肿瘤药理实验方法与技术

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1、第七节肿瘤药理实验方法与技术肿瘤药理实验方法无外乎体内和体外实验两种。从实验目的上看，又可以分成抗癌作用和抗癌作用机制研究两种。一、抗癌作用研究（一）体外实验法：用培养的肿瘤细胞系进行。1、噻唑蓝（MTT）法在培养的活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶可将黄色的四氮唑（MTT）催化成不溶性的蓝紫色的甲替，将甲替用二甲基亚砜（DMSO）溶解后，利用酶标仪（试验波长570nm，参比波长450nm）测定光密度值，按照公式实验组光密度值肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1-）×100%对照组光密度值计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。用系列浓度的药物可制

2、作肿瘤细胞生长抑制率的量效曲线。2、染料排斥法本方法是根据活细胞具有排斥某些染料的功能，而死细胞因胞膜破坏而易于被染料着色的原理，在培养的对数生长期的细胞悬液中加入伊红、台盼蓝、或苯胺黑等染料，在室温下放置5分钟后，在15分钟用血球计数板计数200个细胞。根据公式未染细胞数活细胞率（%）=×100%细胞总数3、生长曲线法本方法是根据肿瘤的Gompertzian生长曲线而设计。培养的肿瘤细胞在初期为指数增殖期，随着细胞密度的增加，因代谢产物的积聚和营养物质的消耗，增殖趋于减缓乃至停止，进入所谓的平台期。在培养后的的即刻、1、2、3、4、5

3、、7天的细胞，用台盼蓝染色，细胞计数，然后取细胞对数对培养时间作图可获细胞生长曲线。1）将生长曲线外延至Y轴可获得截距No`，用公式计算药物对增殖细胞的杀伤力（No`是对照组的的截距）2）用Nt代表接种后t小时的细胞数，用公式TD=0.301t/logNt-LogNo计算药物对细胞增增时间（TD）的影响。3）取平台期每毫升的细胞均数，比较细胞生长的饱合密度（Ns）。4、集落形成法本方法利用分裂6代以上的克隆原单细胞子细胞可形成集落成簇（每簇细胞数＞50）的能力，比较药物对单个肿瘤细胞增殖能力的影响。本方法有贴壁法和半固体培养法两种。1）

4、贴壁法需要选用贴壁生长的细胞，按500细胞/ml的浓度接种到35mm培养皿中，培养后弃去培养基，用瑞氏-姬姆萨染色后，在20×解剖显微镜下计数含有50个细胞的细胞集落。2）半固体软琼脂培养法取对数生长的细胞，用含小牛血清的培养液稀释成1000细胞/ml的悬液；溶化5%的琼脂液，并按1：9的比例与含小牛血清的新鲜培养液混合，倒入35mm培养皿（1ml/皿），室温下待琼脂凝固，取0.94ml的细胞悬液，加0.04ml的5%琼脂,加到已制备的琼脂平皿中，室温下凝固。移入培养箱培养。在16×解剖显微镜下计数直径大于75μm的细胞集落。以集落形成

5、抑制百分率对对数剂量作图，可得“S”型曲线，从曲线上求取半数抑制浓度IC50；以集落的存活分数与剂量作图，可获得克隆原细胞存活曲线，方程为S=1-(1-e-D/Do)n，S为存活分数，D为剂量，Do为存活分数每下降1/e时所需的药物剂量，n为外推值。Do越小，药物的杀伤力越大，N越大杀死细胞的药物剂量越大。5、硫化若丹明B法（SRB）法硫化若丹明（sulforhamineB）呈粉红色，溶于水，可与生物大分子的碱性氨基酸结合，这种结合物在波长515nm时的读数与细胞表现出良好的线性关系，可用于细胞的定量。测试的细胞先用TCA固定，去除固定

6、液，加入SRB，室温下静置，然后去除未结合的SRB，用非缓冲tris碱液溶解结合的SRB，在自动化分光光度平板读数仪（515nm波长）测定OD值。可根据下述公式计算:T-T0生长率（%）=×100%C-T0C、T和To分别为对照组细胞，为给药组细胞，另外的对照平板加药时的细胞的OD值。T-T0杀伤率(%)=×100%TT-T050%生长抑制所需的药物浓度(GI50)=×100%C-T0T-T0杀死50%细胞所需的药物浓度(LC50)=×100%T0(二)在体试验法1、小鼠白血病L1210系用甲基胆蒽诱发DBA/2小鼠而得。取接种于DBA

7、/2小鼠第6～7天之腹水，制成细胞悬液，每只小鼠（DBF1或CDF1）腹腔接种活细胞1×105，观察体重变化，计算平均存活时间T/C（T--治疗组存活时间，C--对照组存活时间）。T/C大于125%，并可重复，认为有抗癌活性，T/C大于150%，并可重复，认为具有显著活性。2、大鼠Walker-256瘤本瘤细胞接种在皮下或肌肉成为实体瘤，接种于腹腔则成为腹水瘤。取Walker-256瘤体制成瘤细胞悬液，按106个细胞接种于大鼠大腿肌肉。计算瘤重和T/C。重复实验T/C≤42%，认为有活性。3、Lewis肺癌是一个在C57BL/6小鼠上发

8、现的自发性肺内未分化的上皮样癌。该癌细胞恶性程度高，皮下、肌肉接种对药物的敏感性低，但可向肺转移，静脉接种可在肺形成瘤集落。方法是取接种于C57BL/6小鼠肌肉或腋窝皮下的13～15天的Lewis肺癌，制成