体外放射分析（检验）检验核医学

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1、第四章体外放射分析核医学教研室教学目的掌握体外放射分析的原理（RIA、IRMA）掌握RIA与IRMA的异同掌握RIA、IRMA的基本操作程序掌握RIA、IRMA的基本试剂了解体外放射分析试剂的要求体外放射分析B与F的常见分离方法重难点重点：1、RIA、IRMA的原理2、RIA、IRMA的异同点难点：1、RIA的原理体外放射分析指在体外实验条件下，以特异结合反应为基础，以放射性测量为手段，对生物活性物质进行超微量分析的总称。特点：灵敏度高、特异性强、精密度好、应用范围广、方法简便。按反应机制分竞争性放射分析Competitiveradioassay非竞争性放射分析

2、Non-Copetitiveradioassay一体外放射分析的概述（一）特异性结合1、抗原与抗体2、配体与受体3、底物与酶4、激素与血浆结合球蛋白（二）结合反应动力学规律[L]+[B]=[LB]1、竞争性结合分析[L]+[*L]+[B]=[LB]+[*LB]2、非竞争性结合分析Sp.Ab1+Ag=SpAb1.Ag+*Ab2=Sp.Ab1.Ag.*Ab2+*Ab2（三）放射性测量放射性测量是定量的基础第一节放射免疫分析radioinnumoassay,RIA竞争放射分析放射免疫分析（RadioImmunoAssay,RIA）竞争性蛋白结合分析（Competiti

3、veProteinBindingAssay,CPBA）放射受体分析（RadioReceptorAssay,RRA）[L]+[*L]+[B]=[LB]+[*LB]（一）放射免疫分析原理*Ag+Ag+Ab=(*Ag—Ab)+(Ag—Ab)+*Ag+Ag0MaxMin条件：1、*Ag定量、足量2、Ab限量*Ag>Ab放射性计数[Ag]Ag与*Ag-Ab成反比！专用符号：1、T(Total):加入的*Ag的放射性计数2、B(Bound):*Ag—Ab免疫复合物的放射性计数3、B0Ag=0时*Ag—Ab放射性计数4、F(Free):游离的*Ag的放射性计数T=B+F

4、5、NSB(Non-specificbinding):非特异性结合产生的放射性计数6、结合率：B/T、B/B0、B/F*Ag+Ag+Ab=(*Ag—Ab)+(Ag—Ab)+*Ag+Ag不同坐标体系对应RIA剂量反应曲线（二）RIA的三种基本试剂标准品（Ag）标记物（*Ag）抗体（Ab）放射性免疫及免疫放射分析试剂盒1、标准品化学结构：应与被测物具有相同的化学结构化学纯度：纯品化学度量：准确稳定性：保持生物活性不变2、标记物要求：1、较高的比活度2、生物活性与免疫活性：与标记前一致3、放射化学纯度：>95%4、稳定性鉴定：1、最大结合率2、标准曲线比较法3、稀释曲

5、线比较法3、抗体要求：1、亲和力2、高滴度3、特异性4、可长期保存抗体抗原动物选择佐剂免疫动物、收获鉴定抗体一、多克隆抗血清抗血清的鉴定亲和力：指抗体与抗原的结合能力，常用平衡亲和常数KA表示。特异性：抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合能力的比较，常用交叉反应率（CrossReaction）表示交叉反应率=Y/Z×100%Y：标准抗原取代50%结合率所对应的浓度Z：类似物取代50%结合率所对应的浓度滴度：结合50%标记抗原时血清的稀释度单克隆抗体特点：特异性高抗体成分专一可反复制备制备：1、免疫小鼠，制备脾细胞悬液2、选择培养，用HAT培养基筛选杂交瘤细胞

6、3、检测抗体4、克隆化（三）分离方法1、分离方法的要求1、使结合部分与游离部分尽可能完全分开2、分得的成分便于作放射性操作3、分离效果不受外界干扰因素影响4、操作简便、分离迅速、重复性好5、试剂来源广泛、价廉易得2、常用的分离方法聚乙二醇法（PEG）活性炭吸附法盐析法微孔滤膜法双抗体法SPA法固相抗体法：塑料、纤维素、凝胶颗粒、多孔玻璃微球磁化颗粒法非特异性分离方法特异性分离方法（四）放射免疫分析方法的建立1、反应方式平衡法顺序加样法STAT法2、加样程序实验设计配制试剂加未标记物（标准品或待测样品）加标记物（*Ag）加抗体（Ab）混匀、温育加分离剂、分离B与F

7、测量各管放射性计数，绘制标准曲线由标准曲线反求出样品浓度第二节、免疫放射分析（ImmunoradiometricAssay,IRMA）一、IRMA的原理及方法学单位点系统双位点系统标记第三抗体法双标记抗体法1、单位点系统：[Ag]放射性计数Ag与Ag-*Ab成正比！2、双位点系统用抗原的二株单克隆抗体，一株制备固相抗体（●·Ab1）与标准品或待测样品中的抗原（Ag）结合反应，加入另一株制备标记的抗体（*Ab2），最终结合形成固相抗体—抗原—标记抗体（Im-Ab·Ag·*Ab）复合物，剩余的标记抗体（*Ab）呈游离液态被分离。●·Ab1+Ag●·Ab1.Ag+*A

8、b2●·Ab1·Ag·*