总蛋白提取试剂盒说明书

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1、普利莱基因技术有限公司www.applygen.com.cn电话：010-62053186,62027915Email：sale@applygen.com.cn总蛋白提取试剂盒(TotalProteinExtractionKit)P1250：蛋白抽提试剂盒-I(实体组织和细胞蛋白抽提,100extractions)描述：从组织细胞中提取总蛋白是WesternBlot的关键步骤。实体软组织如脑脊髓富含磷脂，神经血管含大量结缔组织，而脂肪则有大量油脂，常规的方法难以有效从这些组织提取蛋白。本试剂盒为组织或培养细胞总蛋白

2、提取提供完整的解决方案。用裂解-结合缓冲液匀浆裂解实体组织，或直接用裂解-结合缓冲液重悬培养细胞，然后加入抽提试剂去除非蛋白成分，离心、干燥后即可得到总蛋白。蛋白沉淀溶解后用常规方法进行蛋白定量。提取过程可在30-60分钟内完成，可在1.5ml离心管微量提取也可大规模制备，极为简便高效。通常一次提取10-100mg组织所获得的总蛋白可进行几十到上百次分析如蛋白质电泳、WesternBlot、免疫共沉淀。组成1.裂解-结合缓冲液100ml2.抽提试剂100ml每毫升裂解缓冲液和抽提试剂可提取10-100mg组织或1´

3、107细胞。试剂盒的裂解缓冲液是过量的。适用各种实体软组织(>1mg)，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道组织、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等，以及各种原代细胞和永生化细胞系。保存：室温或4ºC保存2年固体组织蛋白提取1.每10-100mg固体组织剪碎后加入0.5-1ml裂解液，放入玻璃匀浆器内上下手动匀浆15次；或用高速机械匀浆器12,000rpm破碎组织。注意：初始组织的量应在10-100mg范围。肝肾组织蛋白含量高，提取时应加较少量的组织，否则形成的蛋白膜厚、致密且难溶。少量小的未破碎组织不影响

4、后续抽提。2.仅取0.5ml组织匀浆液转移到1.5ml离心管，弃去剩余的组织匀浆液。每0.5ml组织匀浆液加入2倍体积的(1ml)抽提试剂充分混匀。室温或4ºC静置10分钟，偶尔晃动。注意：(1)如组织量<10mg，在下一步离心时形成的蛋白膜易碎，静置30min有助蛋白膜形成。(2)提取脂肪组织时应4ºC静置40min以上以充分去除油脂。(3)0.5ml组织匀浆液获得的蛋白足以进行几十次WesternBlot。保证每0.5ml组织匀浆液加入2倍体积的(1ml)抽提试剂是成功的关键。3.10,000g4ºC离心10分

5、钟，溶液分为上下两相，两相中间为蛋白膜。吸除上层液体；随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体。蛋白膜将附着于离心管壁。注意：(1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固，难以溶解。(2)如果不能分相，可再加入50ml蒸馏水混匀离心。(3)如果初始组织量较少(<10mg)，离心后难以得到完整的蛋白膜，此时可吸去上下层液体，加入1ml纯乙醇混匀，10,000g4ºC离心3分钟。弃所有液体，蛋白沉淀在管底。4.敞开管口，室温10分钟空气干燥沉淀。5.每100mg组织所得到的蛋白加200-1000ml用户自备的缓冲液，95º

6、C煮10分钟。室温放置20~60分钟溶解沉淀。参见后面的说明。培养细胞蛋白提取参见固体组织蛋白提取程序中的斜体字注解1.消化洗涤并800g离心收集细胞。每5-10x106细胞加入0.5ml裂解液，振荡重悬，4ºC净置2分钟。2.按比例每0.5ml裂解液加入1ml抽提试剂，振荡混匀。4ºC静置10min。3.10,000g4ºC离心10分钟，溶液分为两相，两相中间为蛋白膜。小心吸除上层相和大部分下层相，保留两相中间的蛋白絮状物。如果不能分相，可再加入50ml蒸馏水混匀离心。4.加入1ml纯乙醇洗涤沉淀。10,000g

7、4ºC离心3分钟，蛋白沉淀在管底。5.去除管中所有液体，敞开管口，室温空气干燥沉淀。6.每1x106细胞可加入50-200ml(或适量)的蛋白溶解缓冲液，95ºC煮5-10分钟，室温放置20-60分钟溶解沉淀。离心除去不溶物。说明1.未溶解的蛋白沉淀不含盐、去垢剂、和还原剂成分。干燥蛋白沉淀可4ºC或－20ºC长期保存。2.蛋白沉淀溶解步骤：(1)溶解于去离子水或用户自备的缓冲液，95ºC煮10分钟。室温放置30~60分钟或4ºCPage2of2ApplygenTechnologiesInc.DocRev0611普

8、利莱基因技术有限公司www.applygen.com.cn电话：010-62053186,62027915Email：sale@applygen.com.cn溶解5小时以上至过夜。12000rpm离心5min去除任何不溶性沉淀。没有去垢剂时沉淀溶解缓慢且某些膜/疏水蛋白不能完全溶解。(2)有效的溶解推荐用此法，用2~5%SDS水溶液、或含5%SDS的自备缓冲