数字化装配工艺管理技术研究

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1、CRISPR/Cas系统摘要：CRISPR技术是近年来兴起的继锌指核酸酶和TALENs技术的第三代基因编辑技术，相比于之前的两种人工核酸酶，其具有许多无可替代的优势，并己在多种动植物中应用。文章就CRISPR系统的发现、分类、作用机制以及其优缺点和对外?碛T玫恼雇?做综述介绍。本文采集自网络，本站发布的论文均是优质论文，供学习和研究使用，文中立场与本网站无关，版权和著作权归原作者所有，如有不愿意被转载的情况，请通知我们删除匕转载的信息，如果需要分享，请保留本段说明。关键词：CRISPR机制；结构；脱靶前目基因编辑指对目标基因进行敲除、替换和插入的遗传操作。最近儿年来基因组定点编辑技术

2、包括人工核酸酶即锌指核酸酶、TALENs[l]、CRISPR/Cas系统。锌指核酸酶是非特异性核酸酶Forkl的切割结合域与有串联锌指结构的锌指蛋白融合成的人工核酸酶，串联锌指结构可特异性的结合DNA序列前者使DNA双链断裂，产生双链断裂。TALENs可以与DNA特异性的识别。其也由非特异性核酸酶ForkI和TALE融合而成。要指出的是，以上二者均会产生双链断裂，而基因组双链断裂时，会发DNA损伤修复机制，包括DNA双链断裂末端直接连接，其常常会造成连接处碱基突变，如果人为的将缺失部位设置在外显子上，可造成移码突变，实现基因敲除；若利用同源重组，人为加入含同源臂外源DNA，经同源重组

3、，将外源同源片段添加到基因组上，即引入了外源基因片段。CRISPR系统是新兴起来的一种基因编辑技术，它存在于细菌，类似获得性免疫。并在多种动植物中得到了应用，本文主要从其历史、机理、发展和应用前景作出综述。1CRISPR/Cas系统的发现和发展最早日本科研组于1987年发现大肠杆菌碱性磷酸酶基因附近存在串联间隔重复，之后发其广泛存在于细菌和古细菌基因组［2］，零二年首次将其命名为CRISPR。零五年，发现CRISPR的间隔序列和细菌内一些染色体外的遗传物质高度同源，因此推测，这可能与细菌抵抗外源基因入侵有关。零六年，利用生物信息学分析，其可能以类似RNAi的方式行使功能。零七年，发现

4、细菌可能利用其抵抗噬菌体的入侵，零八年，又发现细菌可以利用其抵抗外源质粒的转化。至今其功能越来越清晰，秉要性也越来越清晰。2CRISPR的结构和分类其首先包含间隔序列和重复序列，其中，间隔序列高度可变，主要来源于噬菌体和质粒，长度在20〜70bp，不同的基因座之间的间隔序列的数目不同，这样，我们或许可以分析基因座中间隔序列的种类及时间序列，来考虑不同菌的亲缘关系。而秉复序列，也非保守，其长度一般为20〜50bP，但是其两端相对保守，间隔序列与重复序列间隔排列，且重复序列中还存在保守回文结构。之后，人们发现，在其基因座附近还有一些保守的蛋白质基因，即Cas基因，这些基因编码了包括核酸酶

5、、解旋酶、聚合酶以及与RNA结合的结构域。并非每一个CRISPR基因座附近都有相应的Cas基因，但这种产物也可以通过和其他位置的Cas基因编码的蛋白质结合，从而发挥作用。现目前应用最多的为两类，其中，前者含有Cas3蛋白，它具有解旋酶和核酸酶的功能，此系统中多个Cas蛋白与成熟的crRNA结合形成病毒防御复合体，结合外源DNA，形成R环结构，Cas3的核酸酶活性识别R环结构后切开互补链，再通过解旋酶活性和核酸酶活性将非互补链切开。后者含有Cas9蛋白，其参与crRNA的成熟和外源质粒的降解。其存在于细菌中，因为只需要一个Cas参与外源基因剪切，故更为方便。3作用机制其作用机制可以分为

6、三个步骤[3]:(1)获取新的间隔序列。(2)将新引入的原间隔转录。(3)和Cas蛋白形成复合物精准作用入侵基因座。最后一种应用最多，因为其只需要Cas9参与剪切。其有2个核酸酶结构域：氨基端结构域和中间位置的核酸酶结构域，核酸酶结构域可以切割与前转录物互补配对的模板链，切割位点位于PAM上游，氨基端结构域可对另一条链进行切割，切点位于PAM上游。在前转录物与tracrRNA形成的双链RNA的指导下，Cas9蛋G将靶点切割［4］。4脱靶问题脱靶即对基因组非特异性切割。理论上该系统脱靶的概率会较高，特别是最近有科研组发现在人类中，最多存在五个错误碱基的情况下，系统仍然会对该位点进行切割

7、，造成脱靶。因此系统特异性的提高十分重要，主要有以下措施［5］:(1)突变核酸酶的氨基端结构域或中间核酸酶结构域，使其变为切口酶，在不引起非同源末端连接修复机制前提下激活同源重组修复机制，降低细胞毒性。(2)利用生物信息学手段对其同源蛋白进行预测，寻找高特异性核酸酶。5优势及应用前景(1)靶向精准性高，其可以经改造为切口酶，不会引起非同源末端连接，伹同源重组机制仍可被激活，故可以作为切门酶來实现目的基因的定点敲入或点突变，大大降低非同源末端连接的风险和脱靶