及其在基因功能研究中的应用课件 (2)

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1、RNAi及其在基因功能研究中的应用余方2003-4-28RNAi现象RNAi现象的发现：1995年，SuGuo等人利用“反义”RNA抑制C.elegans中par-1基因时，意外发现不仅“反义”RNA能够起到抑制基因表达的作用，“正义”的RNA同样能够导致“基因沉默”。后来的研究发现是由体外转录制备RNA时污染了微量的双链RNA所致。RNAi—双链RNA介导的特异性阻断相应基因表达的现象为RNAinterference(RNAi)。RNAi现象广泛存在于线虫，果蝇，斑马鱼，真菌以及植物等生物体内，这些生物体利用RNAi来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。RNAi能高效特

2、异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。RNAi现象的普遍性RNAi机制参与RNAi反应的酶：Dicer(RNA酶Ⅲ家族的一个成员):切割双链RNA，由一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点构成。RdRP（RNA-directedRNApolymerase）：以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶RDRP－RNAdependent-RNApolymeraseRISC－基因沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex）1.dsRNA在细胞质内的降解-22bpSiRNA2.siRNA作为guideRNA，

3、与RISC复合物结合，导致靶mRNA的降解3.信号的放大与远距效应RNAi现象的分子机制1.dsRNA在细胞质内的降解-22bpSiRNA2.siRNA作为guideRNA，与RISC复合物结合，导致靶mRNA的降解3.信号的放大与远距效应RNAi现象的重要特征转录后水平的基因沉默很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA高效性（放大效应）远距离效应/遗传效应RNAi与共抑制及基因压制等基因沉默现象的关系共抑制（co-suppression):1990年由Jorgensen在矮牵牛中发现的一种转基因同时抑制相应内源基因及自身表达的基因沉默现象。后来发现在线

4、虫、果蝇等动物中也存在这一现象。基因压制（quelling)：1994年由Macino和Cogoni在粗糙脉孢霉中发现的转基因抑制自身和相应内源基因表达的基因沉默现象。随后发现在其他真菌中也存在这一现象。基因沉默转基因沉默分为转录水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)和转录后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)两种。TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默；PTGS则是指转基因能够在细胞质里被稳定地转录，但在细胞核里却无相应的mRNA存在这一现象。RN

5、Ai、共抑制、quelling均属于PTGS！RNAi的生物学意义抗病毒在植物中，共抑制是植物抗病毒的侵染的一种防御措施转座子沉默通过对果蝇及线虫的研究，人们已经将动物中的RNAi与转座子沉默联系起来发育过程中的作用线虫中的EGO-1蛋白不仅是RNAi过程所必须的，也是线虫胚胎发育所必需的。这说明RNAi在发育过程中很可能具有重要作用。因此，RNAi等PTGS现象是生物体限制或（和）调节被机体认为是外源、非正常的基因表达，从而保护生物体的方式；从更广泛的意义上，RNAi或许是真核生物在长期的进化过程中形成的广泛存在的“管家”机制（house-keepingfunction

6、），在转录后水平调控基因的表达。RNAi在功能基因组学中的应用优点简单的由体外转录或构建质粒使之在体内表达来获得瞬时的或可诱导、可遗传的dsRNA具有多种应用方式；RNAiVsGeneknockout缺点基因不一定被完全抑制，并可能对高度表达的基因不起作用果蝇获得突变体的传统方法：遗传选择的组合、P转座因子的插入或γ-射线照射后遗传缺陷型分析RNAi：（PNASUSA,2000,97:6499-6503）C.elegans:大规模基因功能分析哺乳动物：人工合成的带有3’突出的21个碱基的siRNA（Nature,2001,411(24):494-498）寄生虫防治（Nat

7、ure,2000,408(16):331-336）RNAi用于基因治疗……RNAi在某个基因表达异常增高引起的疾病中会非常有用，如病毒感染(HIVorRNAvirus)，肿瘤等。RNAi已被证实能指引植物干细胞的分化，也可能参与指导人的干细胞的分化。PotentialuseofRNAitools.SyntheticsiRNAsandvectorsforinductionofgenesilencingbyRNAicannowbeappliedforselectiveinactivationofdominantoncogenes,