饲料中莱克多巴胺的hplc法测定

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1、饲料中莱克多巴胺的HPLC法测定       摘要用碱性甲醇提取试样中的莱克多巴胺，经SLA固相萃取柱净化，浓缩后用2％乙酸溶液定容，过膜后用高效液相色谱－荧光检测法分离测定；色谱柱类型WatersSymmetryC18柱，250mm×4.6mm（i.d.），粒径5μm；流动相为戊烷磺酸钠溶液∶乙腈(体积比80∶20)；激发波长为226nm，发射波长为306nm；流速1ml／min；进样量50μl；饲料中莱克多巴胺的检测限为0.5mg/kg；莱克多巴胺的测定在0.02～0.50μg／ml范围内具有良好的线性关系，平均

2、回收率在85.1％以上，RSD小于7.5％；方法简单，灵敏度高，可用于饲料中莱克多巴胺的含量测定。   关键词莱克多巴胺；残留；饲料；高效液相色谱法   中图分类号S816.7莱克多巴胺是苯乙醇胺类β2－肾上腺素兴奋剂，能促进动物体蛋白质沉积，抑制脂肪沉积，具有营养“再分配效应”[1,2]。因此，有人用来作为饲料添加剂，提高猪酮体的瘦肉率。但是，动物在饲用含莱克多巴胺的饲料后，会造成肌肉及组织中不同程度的残留，使用不当将导致消费者出现不同程度的中毒现象。为保障人民的身体健康和生命安全，保障畜牧业的健康持续发展，我国已

3、经明确将其列入禁用药品目录。然而，在饲料或饲养过程中违法使用莱克多巴胺的现象已经出现，并有蔓延之势。   由于莱克多巴胺是一种新型的β2－肾上腺素兴奋剂，目前的检测方法和检测标准很少[3,4]，特别是国内尚未见文献报道。因此探索饲料中莱克多巴胺的检测方法具有很重要的意义。我们比较了提取剂、提取方法、固相萃取柱、萃取试剂、流动相对提取效果的影响，在此基础上对HPLC测定方法进行了系统考察，即线性范围、重复性试验、稳定性试验、加标回收率等，最终确定了一套比较理想的检测条件。1实验部分1.1仪器与试剂   Waters26

4、95高效液相色谱仪；WatersW-474荧光检测器；PELS-45型荧光分光光度计；KQ-500超声波振荡器；Sigma2k15冷冻离心机；BüCHIB-490旋转蒸发仪；MS2minishaker漩涡混匀器；METTLERAG-285电子天平；氮吹仪；SLA固相萃取柱（500mg/5ml），杭州富裕科技服务有限公司提供。莱克多巴胺对照品；高效液相用乙腈为色谱纯，美国TEDIA；水为超纯水；戊烷磺酸钠为色谱级；其它试剂均为分析纯。1.2色谱条件   色谱柱类型WatersSymmetryC18柱，4.6mm×250

5、mm（i.d.），粒径5μm；流动相为戊烷磺酸钠溶液（取800ml水，加20ml冰醋酸和0.87g戊烷磺酸钠）∶乙腈(体积比80:20)；激发波长为226nm，发射波长为306nm；流速1ml／min；进样量50μl。1.3标准曲线的绘制   精密称取25mg莱克多巴胺对照品置于100ml棕色量瓶中，用甲醇溶解后定容，摇匀，为莱克多巴胺储备液。精密量取莱克多巴胺储备液1ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得莱克多巴胺工作液。分别准确吸取一定量的标准工作液，用2％乙酸溶液稀释、定容，配制成浓度为0.02μg/ml

6、、0.04μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml的标准溶液，分别进行HPLC检测。1.4样品提取与纯化   称取饲料3.0g，准确加入2％氨/甲醇溶液25ml，涡旋振荡1min，超声振荡10min，5000r/min离心5min，取上清液10ml至鸡心瓶中，50℃旋转蒸干。用2mL甲醇和2ml正己烷溶解鸡心瓶，重复一次，弃去上层；再加入2ml正己烷，重复一次，分出甲醇至10ml离心管中，45℃氮气吹干。用5ml乙酸乙酯溶解，加少量无水硫酸钠，5000r/min离心3min。洗涤液过SLA固相

7、萃取柱（先经5ml乙酸乙酯润洗）用50％乙腈/乙酸乙酯溶液3ml洗涤柱子，然后用50％甲醇/乙酸乙酯溶液5ml洗脱收集，氮吹至干。用2％乙酸溶液定容到1ml，过膜，上机。2结果与讨论2.1色谱条件的优化   由于莱克多巴胺的紫外最大吸收波长在224nm左右，如果用此波长作为检测波长，则杂质干扰很大。由于莱克多巴胺具有荧光吸收，故我们采用荧光检测器进行检测。结果表明激发波长为226nm，发射波长为306nm时，吸收最强。流动相为戊烷磺酸钠溶液与乙腈经一定的配比而成，通过调整配比，流动相为戊烷磺酸钠溶液∶乙腈体积比为80

8、∶20时，莱克多巴胺的保留时间比较适合，避免了杂质峰的干扰。2.2线性关系与线性范围   将绘制标准曲线用莱克多巴胺工作液按浓度从低到高，依次进行高效液相色谱分析。按其所得峰面积与对应的工作液浓度作标准曲线图，并计算回归方程和相关系数。莱克多巴胺浓度与峰面积的回归方程为：y=10080548x+6438，相关系数r=0.9999，在浓度0.02