pcr分子诊断技术课件

《pcr分子诊断技术课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、PCR分子诊断技术王洋2016.12.27内容PCR技术的概念及发展简史PCR反应的基本成分PCR基本原理和反应过程实时荧光定量PCR检测基本原理和方法PCR技术的应用、临床意义及发展趋向临床PCR检验的实验室管理PCR技术的概念及发展简史PCR概念PCR的由来是Polymerasechainreaction的首个字母的组合，是聚合酶链式反应的简称，是一项体外扩增DNA序列的技术。PCR发展简史1985年美国科学家KaryMullis在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，从此PCR技术得到了生命科学界的认同，并与1993年获得了诺贝尔化学奖。1198

2、8年saiki从水生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶，此酶能耐高温，在热变性中不会失活，从而解决了PCR操作技术中酶钝化为实际操作而带来的困扰，极好的提高了PCR的扩增效率，从此，此酶被命名为TaqDNA聚合酶。自PCR方法不断改进后，现PCR方法已衍生几十种之多，目前实时荧光定量PCR方法已被临床广泛应用，不仅可以用于定性检测而且可以确定原始样品含量。广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学研究中，由于PCR方法有着极强的实用性，因此仍会被不断完善，进一步在生命科学研究中发挥更好的作用。PCR反应的基本成分模板是待扩增序列的核酸，包括基因组DNA、质粒DN

3、A、噬菌体DNA、cDNA、mRNA和细胞等都可以作为PCR反应的模板。特异性引物是与靶DNA3’和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。热稳定DNA聚合酶是PCR技术实现自动化的关键，是从嗜热古细菌中最早分离出的，最常用的DNA聚合酶。2脱氧核甘三磷酸（dNTP）标准PCR反应体系中包含4种等物质的量浓度的脱氧核甘三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。二价阳离子所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，常用的是Mg2＋，Mn2+缓冲液维

4、持PCR反应体系中的PH，使用Tris－Cl缓冲液。一价阳离子标准的PCR缓冲液中包含50mmol／L的KCl，有益于DNA片段的扩增。PCR的基本反应原理和特点PCR原理PCR基本过程类似于DNA的天然复制，特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。整个过程由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。变性：模版DNA经加热至94℃左右，双链之间的氢键断裂，双股螺旋解链，变成两条单链，为与引物结合做准备。退火：DNA加热变性成单链后，当温度降至一定程度（55℃左右）时，引物即与模板DNA单链的互补序列配对结合。延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dN

5、TP为原料，按A－T、C－G碱基配对与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA链互补的链。3重复上述变性－退火－延伸的循环过程，每一循环获得的“半保留半复制”链继续成为下次循环的模板。通常一个完整的循环时间需要2-4min，2-3h就能将靶核酸放大几百万倍。一般临床扩增目的核酸将循环次数设定在40-50个循环之间，以此达到扩增目的。PCR的特点特异性高包括：引物的特异性及延伸时，碱基配对的正确性；TaqDNA聚合酶的稳定性。灵敏度高PCR扩增产物的量以指数方式增长，能在2-3h内，将1个靶分子DNA扩增至10亿个分子，因此一个反应体系中如有2-3个靶分子，则可成功

6、检测出目的基因。简便快速通过PCR技术可在2-4小时之内获得目的基因，为临床患者提供快速准确的确诊检测。实时荧光定量PCR法概念指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化来及时分析目的基因的拷贝数目，通过与已知量的标准品进行比较，实现实时定量的方法。反应过程在实时荧光定量PCR反应过程中，对整个过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。产生的DNA拷贝数是呈指数方式“S”增加的，随着反应循环数的增加，最终不再以指数方式生产模板，而进入“平台期”。4实时荧光定量PC

7、R法荧光阈值和循环阈值荧光阈值（threshold）概念：是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准，即PCR扩增产物量的标准。循环阈值（cyclethresholdvalue，Ct）概念：PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数。特点操作简便、快速、高效、较高的灵敏性及特异性、污染性低。PCR技术的临床应用、意义及发展趋向PCR临床应用感染性疾病的诊断与治疗包括：病毒：肝炎病毒、HIV、HPV、流感病毒等细菌：结核杆菌、TP、UU、CT、NG等寄生虫：弓形虫、疟原虫等遗传性疾病的诊断及预防包括：染色体疾病