脑出血后出血灶周围炎性细胞因子的表达

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1、脑出血后出血灶周围炎性细胞因子的表达0引言　　炎性反应在缺血性脑血管病中的作用已有较多文献报道［1，2］，但脑出血后的相关研究则很少.为了提高脑出血的治愈率，明确脑出血的病理生理机制，我们用免疫组化方法对脑出血后不同时间出血灶周围的炎性反应，以及炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和6（IL-6）在脑出血后24h出血灶周围的表达进行研究.　　1材料和方法　　1.1材料正常雄性SD大鼠8只，体质量230～250g，由第四军医大学实验动物中心提供.　　图1－图6略　　1.2方法①动物随机分为实验组与对照组;②实验组4只，采用胶原酶注射制作尾壳核脑出

2、血模型［3］.将动物用10g・L-1戊巴比妥钠（40mg・kg-1，ip）麻醉，固定于立体定向仪上，剃毛，无菌操作下在尾壳核部位定位（前囟尾侧0.8mm，矢状缝右侧3.5mm，深度5mm）注入胶原酶（Sigma公司生产）0.4U（2μL）和1μL肝素，10min内注完，留针10min后拔针，缝合皮肤.对照组4只，采用相同方法在尾壳核注入生理盐水3μL.术后观察动物24h，给予食物和水，注意其行为活动（包括摄食、活动量）的变化.注射后24h取材行免疫组化染色.给予10g・L-1戊巴比妥钠（40mg・kg-1，ip）麻醉，后开胸

3、，经心脏灌注，先用生理盐水100mL冲净血液，然后用预冷的40g・L-1多聚甲醛（pH7.4）固定液500mL灌注，固定完毕，取出全脑，用40g・L-1多聚甲醛后固定2h，再将脑放入200g・L-1蔗糖溶液，4℃过夜.组织块完全沉底后挑选出血灶及其周围组织，用冰冻切片机连续冠状切片，片厚40μm;③采用免疫组织化学ABC法染色.先将切片经0.01mol・L-1PBS漂洗5min×3次后，室温下浸入800mL・L-1甲醇和3mL・L-1过氧化氢封闭30min以消除内源性过氧化酶的影响，0.01mol

4、・L-1PBS漂洗5min×3次.接着用10g・L-1牛血清白蛋白和30mL・L-1正常羊血清在室温下分别孵育切片20min，以阻断组织与抗体的非特异性结合.最后室温下将切片浸入3mL・L-1TritonX-100大约5min增加组织的通透性，以利于组织细胞内抗原的显示.ABC法如下:首先将切片浸入小鼠抗人IL-1β，IL-6和TNF-α液（1∶500，军事医学科学院基础所沈倍奋教授惠赠），室温36h;0.01mol・L-1PBS漂洗10min×3次后入生物素化抗鼠IgG（1∶300，Vector公司，美国），

5、室温3h;再用0.01mol・L-1PBS漂洗10min×3次后最后入生物素化-卵白素-辣根过氧化物酶复合物（ABC，1∶200，NEB公司，美国），室温2h，0.01mol・L-1PBS漂洗10min×3次.用硫酸镍铵DAB蓝色反应法进行呈色，当阳性产物呈深蓝色而背底几乎无色时终止反应，贴片，脱水，透明，封片，BH-2光镜下观察;④对照组切片的免疫组织化学方法，一抗（小鼠抗人IL-1β，IL-6和TNF-α抗体）用牛血清白蛋白稀释液替代，二抗（生物素化的抗鼠IgG）和生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物与实验组相同，染色步骤也相同，结果没有细胞着色.

6、　　2结果　　脑出血后24h出血灶周围呈现明显的细胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6免疫反应阳性.TNF-α免疫阳性最为明显，为;IL-1β和IL-6则染色较淡，均为.TNF-α和IL-1β阳性的细胞主要为星形胶质细胞，细胞形态小，突起多（Fig1，2），而IL-6免疫阳性的细胞则主要为神经元细胞和炎性细胞，包括单核细胞、巨噬细胞等（Fig5）.对照组仅有较少量的细胞因子表达或无表达（Fig3，4，6）.3讨论　　脑出血急性期血清和脑脊液中炎性细胞因子水平均高于健康对照组，脑脊液中IL-1β和IL-6水平在出血后2～3d达高峰.IL-1β增强了炎性细胞和内皮细胞的粘附能力，介

7、导了脑出血局部的炎症反应的发生［5］.脑室内注入IL-1β和TNF-α均可加重脑水肿，二者使血脑屏障（BBB）破坏，通透性增加，引起脑细胞特别是星形胶质细胞的肿胀和变性，继而释放各种神经毒性因子加重BBB破坏和细胞膜损伤，产生和加重血管源性及细胞毒性脑水肿［6］.另外，IL-1β是一种神经保护因子，IL-6是一种神经营养因子，二者的升高对于脑出血的预后具有重要的意义.而且在临床上用IL-6水平可以早于CT预测脑出血患者脑损伤范围的大小［5］.缺血性脑血管病时TNF-α升高，在早期