免疫荧光双染和细胞化学dab染色步骤

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1、制备细胞爬片1、在无菌培养皿或6孔细胞培养板中铺上灭菌后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液（细胞密度为2×105/ml）。再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖满盖玻片。将培养皿（6孔细胞培养板）置于37℃，含5%CO2及饱和湿度的CO2培养箱中培养。2、4小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的底面。3、倒置显微镜下观察，当细胞增殖到合适的密度后取出培养皿中止培养（一般为1-3天）。　4、倾去培养液，加PBS（PH7.2～7.4）洗涤细胞爬片2次，每次1min。5、加10%中性多聚甲醛（或-20℃预冷的丙酮

2、）固定10～15min。6、吸除固定液，加PBS再洗涤细胞爬片3次，每次5min。7、置于室温下干燥1小时，如暂不染色，先放在-20冰箱中保存。8、取出盖玻片时注意盖玻片的正反面（有细胞的为正面）。将硅化玻片放入饭盒（金属），排好顺序，一定要放平，消毒，将消化好的细胞滴在硅化玻片上，可一片滴两滴，放入培养箱2小时，待细胞贴片，2小时后取出加培液至没过玻片，放培养箱过夜，取出后即丙酮固定，偶做过，效果不错的。免疫荧光双染用两个不同的物种的原始抗体的双免疫荧光染色基本方案1)冰冻切片，晾干，4%多聚甲醛固定10～15m

3、in。（细胞爬片固定后，以下步骤一样）2)漂洗和稀释：在10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，150mMNaCl（PBS）中漂洗切片，3×5分钟。PBS液是用来漂洗和稀释的。其他缓冲液如Tris缓冲碱（TBS）也可用。3)在细胞爬片上加0.03%-1%TritonX-100溶液处理15min。（若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省略），PBS液洗3×5分钟4)阻断步骤：用含5%的正常二度抗体物种来源血清的PBS孵化切片60分钟。（37℃）（一抗前不洗，只甩干）5)原始抗体：在切片上吸干多余的阻断液，在室温下孵化60

4、分钟或在4℃下相应地用稀释的两个物种（如鼠和兔）的未标记的一度抗体混合一起孵化过夜。当用荧光标记的原始抗体用于直接免疫染色（一度抗体）时，你可以跳过用二度抗体的间接免疫染色方法（二度抗体）的步骤（6）。（4℃过夜最好）在PBS液或TBS中漂洗3×5分钟。6)二度抗体：用一对不同荧光素标记﹡﹡的二度抗体﹡，用以结合相应物种原始抗体的IgG，在室温下孵化切片60分钟，在PBS中漂洗3×5分钟。7)复染：如果必要进行核染色如用DAPI（5μg/mlPBS中5min）。在PBS中漂洗切片3×5分钟。8)选择性：为了阻止荧光

5、标记从抗体上脱离，也为了更长的保存以保护染色，在水溶性媒介使用前，推荐在含4%甲醛的PBS液中简短的处理（1-3分钟）。在PBS中漂洗切片2×3分钟。9)锚定：对于荧光显微镜，用抗褪色媒介锚定切片。注释：﹡一般来说，两种二度抗体来自同一物种进行双/多标记﹡﹡当用生物素标记的二度抗体时，在进行复染色（步骤7）前，应首先用荧光标记的（链）亲和素的ABC技术（见6.2.1章节）来观察生物素。细胞爬片的免疫化学染色法（DAB染色）1、在细胞爬片上加0.03%TritonX-100水溶液处理15min。（若是要检测的抗原表达

6、于胞膜，此步可考虑省略）2、吸除0.03%TritonX-100，加3%H2O2孵育10min。3、吸除3%H2O2，加2%牛血清白蛋白封闭30～60min。PBS洗5min。4、吸除PBS，分别滴加相应的一抗（用含1%牛血清白蛋白的PBS液稀释到合适滴度），置于37℃孵育1h，或置于4℃冰箱中过夜。阴性对照片此步用PBS替代一抗。5、吸去一抗，PBS漂洗3次，每次5min。滴加山羊抗鼠的IgG抗体-fitc多聚体，37℃孵育30min。6、PBS漂洗3次，每次5min。新鲜配制DAB显色液，滴加后作用3～5min

7、，置于显微镜下观察染色结果。7、双蒸水漂洗后，滴加苏木精染液，染色10min。(1-2分钟就够了染得太浅要再染!)8、双蒸水漂洗后，滴加0.5%HCl-70%Ethanol（乙醇），作用1min以分色。9、双蒸水漂洗后，滴加1%NaHCO3作用3～5min以蓝化细胞核。10、双蒸水漂洗1min，然后将细胞爬片经70%、80%、95%、100%、100%乙醇各1～2min梯度脱水。11、入二甲苯透明2次，每次5min。(可以1-2分钟)12、室温下晾干，用中性树胶封片。13、显微镜下观察染色结果，并拍照。