苦参碱对肝癌细胞增殖及其细胞自噬的影响

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1、苦参碱对肝癌细胞增殖及其细胞自噬的影响　　[]目的探索苦参碱对肝癌HepG2细胞增殖及其细胞自噬的影响，为临床探索有效的肝癌综合治疗方案提供实验依据。方法采用MTT法和流式细胞仪检测肝癌HepG2细胞增殖抑制率及其细胞周期的变化；荧光显微镜定性观察肝癌细胞自噬情况。结果苦参碱抑制肝癌HepG2细胞的增殖，且随苦参碱浓度的增加和时间的延长，肝癌HepG2细胞的抑制率增加（P<0.05）。流式细胞仪检测示：苦参碱组细胞周期中G1期细胞增多，S期细胞减少（P<0.05）。荧光显微镜检测：肝癌HepG2细胞质中有自噬体形成，且随苦参碱浓度的增加，自噬体越来越多。结论苦

2、参碱对肝癌HepG2细胞增殖有一定的抑制作用，苦参碱抑制肝癌细胞的同时诱导了自噬的产生。苦参碱诱导肝癌HepG2细胞自噬多发生在细胞周期的G1期。[关键词]苦参碱；肝癌细胞；自噬；细胞周期[]R735.7[]A[]1674-4721（2013）03（a）-0011-03在中国传统医药中，苦参碱是一种从苦参、山豆根中提取的生物碱，其分子式为C15H24N2O。而苦参碱早被广泛用于治疗病毒性肝炎、肝纤维化、心律失常等疾病[1]。国内外研究表明[2]：无论是在体内还是体外，苦参碱具有较高的抗肿瘤活性。它可以抑制肿瘤增殖、诱导分化、诱导凋亡、抗转移等作用，同时又具有免疫调节、升高

3、白细胞、缓解癌痛等许多常规化疗药物所不具备的优势。此外，研究发现苦参碱诱导了大鼠C6胶质瘤细胞的自噬[3]。而自噬与肿瘤关系密切，同样在抑制肿瘤中起着非常重要的作用[4-5]。细胞自噬在辅助化疗药物治疗恶性肿瘤方面起着非常重要的作用。本实验通过研究不同浓度的苦参碱作用于肝癌HepG2细胞，探讨苦参碱对肝癌HepG2细胞细胞周期以及细胞自噬的影响，为临床化疗药物治疗肝癌提供理论基础。1资料与方法1.1一般资料肝癌HepG2细胞由北京协和医学院提供。苦参碱（Matrine，广州白云山明兴制药有限公司）、DMEM4.5g/LGlu（Gibco公司）、PBS液、胎牛血清（美国Si

4、gma公司）、单丹磺酞戊二胺（MDC）（美国Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO）、荧光显微镜（日本OlympuS公司）、CO2培养箱、离心机（北京医用离心机厂）、流式细胞仪（美国BD公司，型号：FACSCalibur）、电热恒温培养箱（河北省黄石市医疗器件厂）等。1.2方法1.2.1细胞培养及处理将肝癌HepG2细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养液的培养瓶中，在37℃、5%CO2、饱和湿度下常规培养。显微镜下观察细胞贴壁达80%时，用胰酶消化处理，取对数期细胞进行实验。1.2.2MTT法肝癌HepG2细胞用0.25%胰酶处理制成单细胞悬液，以每孔约104个细胞接

5、种于96孔板（每孔100μL）。分别加入不同浓度的苦参碱溶液，使其终浓度为0.5、1.0、2.0mg/mL，每个浓度设三个孔。然后在加培养液100μL，每孔总体积为200μL，同时设定空白孔及对照孔。然后放回CO2箱中培养24、36、48h。分别在各个时间段结束前4h加入MTT（5mg/mL）溶液10μL，反应4h离心弃上清液。每孔加入DMSO150μL振荡荡5～10min。用酶标仪测定波长为490nm的吸光值。根据公式计算：肿瘤细胞增值抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）100%。1.2.3流式细胞术分析细胞周期肝癌HepG2细胞以5

6、104/mL接种至6孔板中，细胞贴壁后，分别加入0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL的苦参碱，培养36h后，收集细胞，并用流式细胞仪行细胞周期分析。1.2.4单磺酰戊二胺（monodansylcadaverine，MDC）荧光染色将DMEM液培养的肝癌HepG2细胞以1104/mL接种至12孔板中，待细胞贴壁后，分别加入0.5、1.0、2.0mg/mL的苦参碱，培养36h弃培养液，用PBS液洗2遍，加入50μmol/LMDC，37℃孵育10min染色。再用PBS漂洗细胞3次，在荧光显微镜下观察。1.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件分析数据，计

7、量资料采用x±s表示，组间比较采用重复测量方差分析。检验水准（α）为0.05。多组间计量资料采用单因素方差分析检验；两组间计量资料采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1苦参碱显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖MTT测定结果见图1，苦参碱显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖，并呈现时间-剂量依赖性。见表1。苦参碱0.5、1.0、2.0mg/mL作用于肝癌HepG2细胞36h后的抑制率分别：（17.21±2.02）%、（28.25±3.20）%、（38.77&