实验七 连续记录法测定过氧化氢酶活力

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1、一. 目的   了解酶活力测定的基本原理与酶活力表示法   掌握简易凝胶层析与过氧化氢酶活力连续记录测定的操作与计算二. 原理   过氧化氢酶（Catalase，CAT，EC1.11.1.6）是以亚铁原卟啉为辅基的生物体内清除H2O2的重要酶之一，其催化的反应为：   通过上述反应，CAT可以降低生物体内有毒害作用的过氧化氢水平，减少自由基和过氧化脂质的形成，对生物体起重要的保护作用。   传统测定CAT活力（活性）的方法有滴定法和测压法，但这两种方法不仅误差较大，且比较复杂。本实验采用紫外分光连续记录测定法，具有操作简单，灵敏度高，结果直观的优点。

2、   测定时，酶反应在紫外分光光度计的石英比色皿中进行，分光光度计与记录仪相连接，由于H2O2在240nm处有吸收峰，加入酶液后会使A240下降，而A240下降的情况又可以记录在纸上，从记录的初始直线段计算A240的变化速率DA240·min-1，最后根据酶液体积和样品鲜重可以直接算出DA240·min-1·g-1Fw并以此来表示样品中CAT活力的大小。三. 实验材料及设备   1. 材料       小麦叶片（或其它禾本科植物叶片）   2. 仪器       电子天平 高速冷冻离心机 记录仪 紫外分光光度计   3. 器材       层析柱：1

3、套       刻度试管：5mL×10       移液管：   5mL×1       微量进样器：1000ml×1 200ml×1 （可调）       塑料离心管：7mL×1       小试管：1支       滴   管：   2       洗耳球：   2       硫酸纸       研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制   1.提取缓冲液（0.05mol/L、pH7.0PBS，内含l%PVP）   2.CAT反应液(0.05mol/L、pH7.0PBS，内含0.015mol/LH2O2)   3.层析介质：Se

4、phadexG-25五. 操作步骤   1. 粗酶液的制备   (1)取材：称取0.5g左右的生物材料，记下实际质量。   (2)研磨：将样品剪碎于研钵中，加入预冷的提取缓冲液5mL，置冰浴上充分研磨。（如不易研磨，加少量石英砂。）   (3)离心：匀浆液全部转入7mL塑料离心管，平衡后于4℃下、以10,000g离心10分钟。上清液全部倒入刻度小试管，准确记下其体积，此上清液即为粗酶液，置于冰浴中备用。   2.粗酶液的初步纯化   （1）上样：用可调微量进样器或移液管吸取1mL粗酶液过SphadexG-25小柱（总床体积7mL）（参照“凝胶层析脱盐

5、”实验的上样步骤）。   （2）收集：每管收2mL，共收集4支试管，然后关闭出口。   （3）检测：将收集到的洗脱液每管取0.4mL到相应的另一支空试管中，用考马斯亮蓝检测是否有蛋白质。   （4）合并：将检测到含有蛋白质的对应的几支管等体积混合，摇匀，即为初步纯化的粗酶液，置于冰浴中备用。   3.酶活力测定   (1)紫外分光光度计与记录仪相连接，波长定于240nm处，记录仪的量程定于50mV处，预热10min，仪器调零。   (2)在光径为1cm的石英比色皿内，先加入3mLCAT反应液，再加0.1mL的粗酶液或初步纯化的粗酶液后（视酶活力大小而

6、定），用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒混匀数次（不要过分剧烈颠倒）；立即把石英比色皿插入比色架上，关盖，同时将记录仪的纸速开关拨至4mm/min处，A240的变化情况被记录于纸上。3min后关闭纸速开关。   (3)重复步骤（2），再测定1～2次。六.结果处理   1.在记录纸上取实验记录得到的直线一段，计算该直线段与记录纸横轴交角的余切值，得ΔA240·min-1，（记录纸的纵轴为时间分钟，横轴为光吸收A240），该余切值代表酶反应的初速度，最后取重复测定的平均值；   2.根据活力测定的酶液加入量、酶液总体积和样品鲜重，计算植物样品中CAT活力，以ΔA

7、240·min-1·g-1Fw表示（包括粗酶液与初步纯化的粗酶液）。七.思考题   1.什么是酶反应进程曲线？它对酶活力测定有何意义？   2.什么是酶浓度曲线？它对酶活力测定有何意义？   3.粗酶液与初步纯化过的粗酶液过氧化氢酶活力哪个大？为什么？如果要计算纯化倍数，还应该做哪些工作，并如何计算？