人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备

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1、细胞与遗传学教研室人类染色体标本的制作一、实验目的1.掌握人类染色体标本的制作方法2.了解人类染色体形态结构特征二、实验原理外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物凝集素（PHA）时，小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经过短期培养后，用秋水仙素处理、低渗、固定、滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察.这种培养方法是Moorhead于1960年建立的。PHA37℃68h秋水仙素至72h外周血淋巴细胞G0期或G1期四、实验方法1.外周血细胞培养（1）采血：无菌，肝素抗凝。用无菌注射器抽取肝

2、素0.2ml,润湿针筒,推出多余肝素.消毒后,抽取受试者静脉血2ml。）（2）接种培养：每培养瓶加入0.3～0.5ml（10滴）,接种于装有5ml培养基的培养瓶中，摇匀，37℃培养箱中培养68小时。（20滴）（3）秋水仙素处理：0.05～0.4μg∕ml培养基，轻摇混匀后，继续培养至72小时。实验方法2.染色体的制备（1）收获细胞：用吸管吸取培养物，移至离心管中，以1500转/分离心10分钟，弃去上清液，留下沉淀物约0.3ml。（2）低渗处理：加入预温37℃的低渗液至8ml，用吸管轻吹打混匀，置于37℃恒温水浴锅中低渗20分钟。低渗后吹打要轻,以防细胞破裂.（3）预固定：缓缓加入1ml新配制

3、的固定液（甲醇：冰乙酸=3:1），立即用吸管轻吹打混匀。以1500转/分离心10分钟，弃上清液，留约0.3ml沉淀物。（4）固定：加入新鲜固定液至8ml，吸管吹打混匀，室温固定20分钟，1500转/分离心10min，去上清液。依上述方法再重复固定1次。实验方法（5）制备细胞悬液：预留0.2～0.3ml固定液，加2滴新配固定液制成细胞悬液（6）滴片：吸取细胞悬液，滴2～3滴于冰镇的载玻片上,于酒精灯火焰上过火后，空气干燥。(每组3张，只染1张）（7）染色：Giemsa染液染色10分钟，自来水轻冲洗，晾干，镜检。五、实验结果在低倍镜下选择分散良好，长度适中的分裂相，再转至油镜观察。六、实验注意事

4、项1.接种的血样愈新鲜愈好。2.培养中成败的关键,除了至为重要的PHA的效价外。培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要。3.培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养。4.制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开,可将固定时间延长。每组上交2张未经染色染色体标本。