木糖还原酶基因克隆及表达菌株之代谢工程改造

《木糖还原酶基因克隆及表达菌株之代谢工程改造》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、木糖还原酶基因克隆及表达菌株之代谢工程改造第一章文献综述1.1木糖酵简介木糖醇具有和蔑糖相似的甜度，外观也很相似，木糖醇口感清凉，目前已广泛在高档食品中用作甜味剂和增味刹。日常生活中食糖过多容易产生铺齿，鉴于这个问題，人们一直在寻求新型食糖替代品。国外比较成熟的营养性食糖替代用品，主要是山梨醇和甘露醇，这些多元醇外观和蔑糖相仿，但甜度不及蔑糖的一半（图1.2)，所以用作庚糖的替代品并不理想。而木糖醇作为一种理想的营养性甜味刻，除了不造成銷齿和不影响糖尿病人的血糖值外，甜度还比庚糖略髙，并能和蔑糖同祥地食用和应用于食品加工业。随着相对湿度的变化，木糖醇的吸湿性也随之发生变化，如表1.2

2、所示。由于木糖醇有一定的吸湿性，而纯粹的蔑糖较少有吸湿性，故木糖醇不适用于制取干脆的食品，例如用木糖醇代替庚糖制饼干，烘烤成后，在空气中放久，就会变软。但如用其制作一些松软的点心时，则点心能比使用庚糖保持更长时间的松软性。蔑糖在食品加工受热时，会和裁基酸产生美拉德反应，即糖类的酸基和裁基、酸反应，生成一种褐色并有焦、糖味的物质。这对于面包生产是不可缺少的，但是对于绝大多数的食品加工却是一个不利因素。木糖醇热稳定性好，10%木糖醇水溶液的pH为5.0-7.0，不与可溶性氛基化合物发生美拉德反应。在食品加工过程中比较稳定，这对某些食品中用木糖醇代替麓糖有很大意义。1.2木糖博的生产近年来

3、，酵母或其菌细胞中的木糖代谢途径已经被广泛探索，由图1.4知，自然界中微生物利用木糖的途径主要有两种：一、在依赖于NADPH的木糖还原雖(XR)的作用下，还原成木糖酵,然后在依赖NAD+的木糖酵脱氣海(XDH)的作用下，木糖酵被氧化为木酮糖，再通过木酮糖激海（XK)的作用使木酮糖转化为5-碟酸水酮糖，而后进入碟酸戊糖途径（或称HMP途径），其中间产物6-碟酸菊萄糖和3-碟酸甘油酸可通过EMP途径生成两酮酸。二、木糖在木糖异构酶（XI)的作用下直接生成木酮糖，而后木酮糖的代谢途径如前所述。发现在200r/min条件下，D-木糖在84h的发酵时间里木糖消耗率分别为：C.t基因的克隆...

4、.....433.4.2电转化和FLP位点专一性重组后检测图谱........443.5本韋小结........46第四章基因工程菌发酵生产木糖醇工艺的优化........474.1引言........474.2实验材料........474.2.1菌种........474.2.2试剂........474.2.3培养基配制........484.2.4试剂配制........484.3实验方法........494.4结果与讨论........544.5本章小结........60第五章结论与展望........615.1结论........615.2展望........61第四

5、章基因工程菌发酵生产木糖醇工艺的优化4.1引言微生物发酵法生产木糖醇是目前的研究热点。对于大多数微生物而言，利用木糖比利用葡萄糖困难得多。至今为数不多的微生物能发酵木糖，研究发现一些酵母菌以及某些真菌能将木糖转化生成木糖醇。其中，酵母菌是最有效的木糖醇生产菌。但酵母菌中只有一部分能利用木糖，能大量积累木糖醇的更少。因此，构建能高效、大规模发酵生产木糖醇的大肠杆菌菌株尤为重要。本文针对上述构建的产木糖醇基因工程菌株，进行了发酵生产的优化，稀选出木糖醇发酵生产的最佳菌株，为今后发酵条件优化，细胞固定化生产，为实现木糖醇大规模生产提供基础。本文对重组大肠杆菌发酵工艺进行了初步的研究。对摇瓶

6、中培养条件的优化采用单因子实验法，研究了种龄、初糖浓度、温度、培养基初始pH、接种量等对工程菌生长和产木糖醇的影响，确定了最佳培养条件为：种龄12h，初糖浓度60g/L,温度28°C，pH7.0,接种量10%。通过四因素三水平正交实验，得出对木糖醇产率的影响因素由主到次为：温度、转速、pH、初糖浓度。优化后木糖醇的转化率为75.83%，比优化前提高了14.93%。结论本文克隆和表达了木糖还原酶、六碟酸葡萄糖酸脱氣酶、葡萄糖六碟酸脱氧酶，并敲除了大肠杆菌体内木酮糖激酶基因，实现了高效生产木糖醇的目的。本研究的主要结论如下：(1)克隆和表达了木糖还原酶、六碟酸葡萄糖酸脱氢酶、葡萄

7、糖六碟酸脱氢酶，并检测木糖还原醇、六碟酸葡萄糖酸脱复酶、葡萄糖六碟酸脱氢酶的酶活力。通过异两基-B-D-碗代半孔糖苷(IPTG)诱导后表达获得分子量约为38kD,51kD,54kD的三种蛋白。酶活测定显示，重组菌种XR的比酶活为7.25U/mg，6-GPDH的比酶活为2.26U/mg，G6PDH的比酶活为1.31U/mg。(2)利用Red重组系统，成功地敲除了大肠杆菌xylB基因，构建了AxylB/五.co//BL21(DE3)重组菌，同时消除了抗性基因，