绿色荧光标记c

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1、绿色荧光标记C陈腾祥，夏高晓，陈丽，刘亚伟，刘靖华，姜勇【摘要】目的：表达纯化重组的His-EGFP-CRP蛋白，通过毛细管电泳技术对该重组蛋白的生物活性进行评价。方法:用pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化、梯度透析.freelechanismofhumanC-reactiveprotein（CRP）.Methods:There-constructedvectorpET14b/EGFP-hCRPedintoEscherichia.coliBL21（DE3）,

2、inducedbyisopropyl-β-D-thiogalactopyranoside（IPTG）.Theexpressedprotein,His-EGFP-CRP,atographymethodandrefoldedancecapillaryelectrophoresis（HPCE）toevaluateitsisoelectricpoint（pI）andbio-activity.Results:FusionproteinHis-EGFP-CRPsuccessfullyexpressedintransformedE.colicellsaf

3、tertheinduction,andthenatography.His-EGFP-CRPberofHis-EGFP-CRPdetectionpeaksincreasedaftertheproteinaybemonomerorpolymer,oleclesinlysateofTHP-1toformplex.TheseresultssuggesttherebinantproteincouldbeusedinexploitingthefunctionandinternalizationmechanismofhumanCRP.［Keyanceca

4、pillaryelectrophoresis,HPCE）技术对复性后的重组蛋白进行检测分析，以进一步了解该重组蛋白的基本理化特点，检测该蛋白的活性。1材料和方法1.1材料台式低温高速离心机、台式冷冻离心机和PA800毛细管电泳仪（BeckmanCoulter公司）；MiniVE垂直电泳系统（GEHealthcare公司）；原核表达质粒pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP（分别由广东省蛋白质组学重点实验室郭爱华和陈腾祥构建）；大肠杆菌菌株DH5α（本室保存）；质粒纯化试剂盒（U-Gene公司）；异丙基-β-D-硫代

5、半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）由Calbiochem公司生产；microconYM-10超滤浓缩装置（Millipore公司）；TALONMetalAffinityResin（BDBioscienceClontech公司）；透析袋（Merck公司）；人单核细胞系THP-1（香港大学医学院徐爱民教授惠赠）；无内毒素的RPMI-1640培养液和胎牛血清（fetalbovineserum,.freela公司）。1.2方法1.2.1质粒pET14b/MCS-EGFP和pET14b/EG

6、FP-hCRP的原核表达用pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP分别转化BL21（DE3）大肠杆菌菌株，各挑取3个克隆到5mlLB培养液（Amp+）中，37℃振荡扩增，当菌液OD值约为0.4时，加入5μl100mmol/LIPTG到5ml的菌液中，室温振荡4h，取1ml菌液3000r/min离心5min，加入200μl1倍SDS上样缓冲液重悬沉淀，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察蛋白表达情况。各取表达目的蛋白的克隆1ml加入到200mlLB培养液（Amp+）中，按上述表达条件进行大量诱导表达。1.2.2

7、His-EGFP蛋白的纯化按TALONMetalAffinityResin试剂盒说明书，配制结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。200ml转化了质粒pET14b/MCS-EGFP的大肠杆菌经室温诱导4h后，4℃8000r/min离心菌液10min，用4ml冰冷的结合缓冲液重悬细菌沉淀，超声波裂解，4℃12000r/min离心20min，取上清加入到装有TALONMetalAffinityResin的纯化柱中，按操作说明进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用Bradford方法定量。1.2.3His-EGFP-CRP蛋白的纯化配制缓冲液A（5

8、0mmol/LTris-HCl、0.5mmol/LEDTA、50mmol/LNaCl、5％甘油、0.5mmol/LDTT，pH7.9）。200ml转化了质粒pET14b/MCS-