基因工程原理_1

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1、基因工程原理1.2基因工程的诞生理论基础：1.遗传的物质基础DNA2.基因的自我复制和传递（1953）3.遗传信息的流向及表达问题的阐明（1961操纵子；1966中心法则）技术基础：1.工具酶（1967连接酶；70内切酶）2.载体3.逆转录酶发现（70）中心法则的完善助产士1972，P.Berg,美，斯坦福大学DNA体外重组1973,S.Cohen诞生：19731.3基因工程研究内容基因工程：在体外将核酸分子插入病毒，质粒或其他的载体分子上，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内

2、，而能持续稳定的遗传。内容（步骤）1.分离目的DNA片段2.与载体相连成重组DNA分子3.重组DNA分子引入受体细胞4.扩增，获得大量细胞繁殖群体5.筛选具有重组DNA分子的细胞克隆6.目的基因实现功能蛋白的表达第二章基本技术凝胶电泳，核酸分子杂交，序列分析，细胞转化，DNA分子切割与连接等2.1凝胶电泳1.种类：琼脂糖0.2-50kb；聚丙烯酰胺1-1000bp2.原理：电泳的迁移率，核酸的取决于大小与构型（共价闭合螺旋状环形DNA〉开环〉线形）3.E.B2.2细胞转化存在问题：外源DNA片段难直接导

3、入受体细胞即使进入无法复制诱导受体菌成感受态2.3核酸分子杂交1.种类：Southern,Northern2.原理：互补的DNA或RNA混合，同源区段退火形成双链结构3.步骤：核酸印迹转移，核酸杂交（Southern硝酸纤维素滤膜，尼龙膜；Northern叠氮化的活性滤膜）4.用途：亲缘关系，核酸片段中某一特定基因的位置2.4DNA序列分析Maxam,Gilbert化学裂解法；Sanger双脱氧链末端终止法Sanger双脱氧链末端终止法原理：2`,3`-双脱氧核苷三磷酸参入寡核苷酸链的3`末端，无3`-

4、OH末端。反应终止。Maxam,Gilbert化学裂解法原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，造成碱基特异切割。第三章基因操作的工具酶限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶，修饰酶，核酸外切酶，单链核酸内切酶3.1限制性核酸内切酶定义分类：Ⅰ，*Ⅱ，Ⅲ（*1970H.O.Smith,K.W.Wilcon从流感嗜血菌Rd株分离）命名：R.HindⅢⅡ型基本特征：特异识别序列，断裂类型（粘性，平）影响活性因素：纯度，甲基化，分子结构，温度，缓冲液同尾酶，同裂酶3.2DNA连接酶（1967）作用机

5、理：封闭双螺旋DNA上缺口类型：DNA连接酶,T4DNA连接酶DNA片段的连接：粘性末端平末端（1）T4DNA连接酶（2）同聚物加尾法：末端脱氧核苷酸转移酶3`-OH（3）衔接物连接法：10-12，酶识别位点（4）接头连接法：粘，平3.3DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1957，美，Kornberg1.多功能5`-3`聚合酶；5`-3`外切酶；3`-5`外切酶2.DNA杂交探针的制备缺口转移法大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段（Klenow酶）1.活性5`-3`聚合酶；3`-5`外切酶2.用途修

6、补3`隐蔽末端；标记DNA片段末端；CDNA克隆的第2链CDNA的合成；DNA测序T4DNA聚合酶5`-3`聚合酶；3`-5`外切酶逆转录酶1.活性RNA依赖的DNA聚合酶；DNA依赖的DNA聚合酶；外切酶活性3.4DNA和RNA的修饰酶末端脱氧核苷酸转移酶；T4多核苷酸激酶；碱性磷酸酶末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾T4多核苷酸激酶与DNA分子的5`末端的标记碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用第四章基因克隆载体质粒载体，<15kb噬菌体载体，15kbCosmid，31-45kb单链DNA噬菌体M13，1kb

7、动物病毒4.1质粒载体天然质粒：F，R，Col天然质粒特性双链闭合环状DNA分子复制类型不亲和性质粒载体的选择质粒载体具备条件：自主复制；限制酶单一切割位点；筛选标记；小，多拷贝大肠杆菌质粒载体：PSC101，9.09kb；（1973）ColE1，6.3kb；pBR322，4.3kb4.2噬菌体载体噬菌体一般特性核酸，蛋白质外壳温和，烈性λ噬菌体载体(1974)1.λ噬菌体DNA分子，48502bp2.λ噬菌体载体的构建原理：删除多余限制位点e.g.5EcoRⅠ；步骤：类型：插入型：一个替换型：成对3.

8、常用λ噬菌体载体凯伦噬菌体载体：1977F.R.Blattner等4.应用体外包装（5%-75%），23kb4.3柯斯质粒载体柯斯质粒：λ噬菌体cos位点+质粒复制子特点：具有λ噬菌体特性；质粒载体的特性；高容量应用：4.4单链DNA噬菌体载体M13噬菌体生物学特性M13噬菌体载体非必要区：IS类型：插入一个lac操纵子片段；在上一基础上再插入一多限制酶的人工接头应用：4.5真核细胞的克隆载体植物基因克隆的载体：Ti质粒Ti质粒的结构和特性