bio-separation

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1、蛋白质液相层析的策略和技术杨俊超，Bio-RadBeijingOffice蛋白质分离纯化的一般性原则蛋白质液相层析技术蛋白质分析制备液相层析系统现代分子生物学的核心任务：——生命现象的分子机制用某种方法从存在于多数生物体的数万种分子中鉴定分离出目标分子分子本身（和/或其产物）的依序的、成对的和组合的相互作用，以及从分析它们的与这些实验有关的结构等方面，来确定这些分子籍以进行相互作用而产生待研究现象的机理主要的分子机件(molecularmachinery)都是蛋白质历史回顾:糖酵解、氧化磷酸化、蛋白

2、激酶和信号传导机制、大分子（DNA、RNA、蛋白质）的合成、蛋白质的运输和转运、突触处的神经传导作用等现状：DNA有标准的物理化学性质，克隆和测序已变的简便易行蛋白质组学导致大量心得蛋白被发现，蛋白质和已知功能结构域的数据库在丰富新的蛋白质可以用旧的蛋白质及其结构域的变化和线性重组来装配以结构/相互关系为基础的发现途径需要通过表达、纯化和活性实验来证实所认定的功能蛋白质分离纯化的依据不同蛋白质由于氨基酸数目和序列不同，立体结构不同，物化性质不同大小形状电荷等电点电荷分布疏水性溶解度密度配体结合能力金

3、属结合能力可逆性缔合翻译后修饰特异性序列或结构基因工程构建的纯化标志其它非寻常性质蛋白质分离纯化的依据不同蛋白质由于氨基酸数目和序列不同，立体结构不同，物化性质不同大小（大小从几百到一百万。一般10,000~150,000）形状（球型、雪茄型蛋白在电泳、梯度离心、层析时摩擦阻力、扩散速度不同）电荷（天冬氨酸、谷氨酸占优势，pH=7时带负电荷，为酸性蛋白；赖氨酸、和精氨酸残基占优势，pH=7时带正电荷，为碱性蛋白）等电点（蛋白质等电点一般为4.0-10.0之间）电荷分布（荷电残基不均匀分布或成簇分布时

4、往往能以适当的强度与阴阳两种离子交换树脂作用，32pH=7.9时负电荷-46，正电荷+40，能以适当的强度与阴阳两种离子交换树脂作用）蛋白质分离纯化的依据不同蛋白质由于氨基酸数目和序列不同，立体结构不同，物化性质不同疏水性（多数疏水性氨基酸蚕基藏在蛋白内部，但也有一些见于表面。盐浓度增大时往往露出疏水表面）溶解度（溶解度从基本不溶<10ug/ml到极易溶解>300mg/ml,pH、离子强度、离子的性质、温度、溶液极性等影响溶解度）密度（富含磷酸盐蛋白高密度1.8mg/ml，脂质部分密度1.03，可

5、梯度离心）配体结合能力(酶与底物、效应分子、辅助因子、和DNA模板结合)金属结合能力(胱氨酸、组氨酸残基与Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co2+、Ni2+二价金属离子结合)蛋白质分离纯化的依据不同蛋白质由于氨基酸数目和序列不同，立体结构不同，物化性质不同可逆性缔合(蛋白二聚体、三聚体等的可逆变化)翻译后修饰(翻译后加入糖基、酰基、磷酸基团等。糖基与外源凝集素柱子结合，磷蛋白在某些糖基存在下与二价Fe离子)特异性序列或结构(氨基酸残基在蛋白质表面上的精确的几何表象可用来作为分离方法的基础。如免疫亲和层

6、析)基因工程构建的纯化标志(改变cDNA而在被表达的蛋白氨基端或羧基端加几个额外的氨基酸，如6个组氨酸与Ni2+螯合)其它非寻常性质(某些蛋白质还有一些不同寻常的性质，如热稳定性、抗蛋白酶解等，结合二者用来纯化酶等。因大多数蛋白95C时解折叠并凝结或沉淀)未修饰蛋白内电离基团的电荷与pH的关系蛋白的滴定曲线和等电点分子相互作用类型及其影响氢键(质子供体和受体共用一对电荷，受温度、溶液离子强度影响)分子相互作用类型及其影响疏水作用（非极性残基不能与水形成氢键，倾向于避开水）分子相互作用类型及其影响硫

7、酸铵沉淀分子相互作用类型及其影响疏水作用层析分子相互作用类型及其影响等电点沉淀分子相互作用类型及其影响离子相互作用（E=ZaZbe2/drab,d为两电荷距离，rab溶液介电常数）溶剂的离子强度增加、以及当电荷被平衡离子屏蔽时，离子作用减弱。pH决定了荷电残基数目分子相互作用类型及其影响离子交换分子相互作用类型及其影响羟基磷灰石的ProteinBindingMechanismsElectrostatic-Coordinationcomplexes-Repulsion-Geometriccharged

8、istribution-分离方法的类型液相层析蛋白质分离纯化的最重要手段层析的概念流动相固定相C流出组份123123洗脱峰气相色谱很快发展起来，进样、检测高度自动化，用于易气化小分子分析主要取决于层析介质1906年俄国化学家茨维特在碳酸钙上分离细胞色素60年代以后HPLC逐步发展起来，主要用于不易气化的多肽、小分子量蛋白、核苷酸等有机大分子的分析和制备。层析：成熟的技术生物层析——分析、制备“活”的蛋白层析：HPLCVersus蛋白层析系统HPLC蛋白层析系统分子量H