实验讲义-酶制剂生产及应用

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1、尼龙固定化木瓜蛋白酶一、目的：了解共价交联法固定酶的原理和步骤二、原理尼龙是聚酰胺物质，经HCl水解后暴露出游离NH2，NH2与戊二醛反应，尼龙即成活化载体，可与酶表面NH2反应，把酶连在尼龙上。 三、实验材料、仪器和试剂1、材料尼龙布(86或66)，140目，剪成3cm×3cm2、仪器(1)恒温水浴锅(2)紫外分光光度计(3)冰箱3、试剂(1)18.6%CaCl2溶液(2)甲醇溶液(3)3.65mol/LHCl溶液(4)0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)(5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5(6)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8)(7

2、)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液(8)0.5mol/LNaCl溶液(9)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)(10)激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。(11)0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。(12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。四、操作步骤1、固定化酶的制备(1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液10s，再浸入18.6%水的甲醇溶液中，轻轻搅拌5min以上至尼龙发粘。取出后用水洗涤，用滤纸吸干。(2)将尼龙布用3.65mol/LHCI溶

3、液在室温下水解45min，用水洗至pH值中性（pH试纸检测）。(3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。(4)取出尼龙布，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8)洗涤3次，洗去多余的戊二醛，吸干之后，加入5ml1mg/mL的木瓜蛋白酶液，在室温下固定30min。(5)从酶液中取出尼龙布，用0.5mol/LNaCl溶液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。62、酶活力测定A．0.2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+1ml酪蛋白液B．0.2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+2ml10%三氯乙酸+1ml酪蛋白液C.固

4、定化酶一张（剪碎）+2.0ml激活剂+1ml酪蛋白液取三支试管按上述加入反应液，37℃反应15min，A、C+2ml10%三氯乙酸。三支试管过滤上清液到另三支试管中，以B管作空白，测试管A、C吸光值（280nm，紫外）五、结果计算1.酶活定义：每15min增加0.001个消光值所需酶量为1个酶活单位。2.酶活回收=六、注意事项(1)尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。(2)固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。(3)酶活性测定的反应时间一定要准确。实验二、有机溶济沉淀法制备大豆脲酶及其活力测定（4课时）实验类

5、型：综合性实验目的：掌握酶的提取与性质测定中的实验方法，熟悉有关酶提取与活力测定的基本原理和基本操作。实验内容：1．提取：（1）称取约5g人造浮石，置小烧杯中，用2%乙酸浸泡1-2分钟，倾去酸，用蒸馏水洗涤至中性，沥干备用。（2）称取约10g新鲜大豆粉，置于锥形瓶中，加上述人造浮石，加50ml32%丙酮溶液，在冰浴中持续摇动4~5min，4层纱布过滤，收集滤液。（3）将滤渣重新置于锥形瓶中，另加10ml32%丙酮，再提取一次。纱布过滤，滤液在4℃，3500r/min下离心8~10min，倾出上清液，计量体积。取1mL酶液保存，供测酶活力用。2．沉淀酶：（1）将提取的酶液置冰浴中缓慢

6、搅拌下，用滴管逐滴滴加2%醋酸，并不断用精密pH试纸检测pH变化，观察产生混浊现象，至pH4.9左右。置4℃10分钟。（2）4℃63500r/min离心10min，沉淀用电吹风稍微吹干，所得即为脲酶粗品。称重，计算酶收得率。3．脲酶的活力测定：脲酶的活力测定利用脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，氨与纳氏试剂反应生成黄色化合物，吸光度与氨年度成正比，可测定脲酶活力大小。实验要求：提取大豆脲酶，并进行收得率和脲酶的活力测定，结果计算：1）提取制备脲酶的收得率：2）脲酶活力测定：式中：n为酶样品的稀释倍数试管号步骤123（1）酶液（mL，原液或适当稀释）001.00（2）标准硫酸铵溶液（m

7、L）00.300（3）蒸馏水（mL）2.001.701.00（4）10%·三氯乙酸(mL)1.001.000（5）室温平衡5min。（6）3%尿素（mL）1.001.001.00（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min，立即向样品管（3号管）加10%三氯乙酸1.00mL，终止反应。各管摇匀后，取1.0ml溶液置于EP管中，室温、10,000rpm离心5min，吸取0.2ml上清按步骤（8）进行反应。（8）另取3支洁净的试管，分别对应于上述各管，进行后续反应。①反