细胞因子生物学活性检测

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1、细胞因子生物学活性检测　　细胞因子水平测定是细胞免疫功能检测的一个重要组成部分。由于许多细胞因子cDNA克隆和表达的成功，给细胞因子单克隆抗体制备、生物学功能的鉴定提供必要条件。目前检测细胞因子水平主要包括两类方法：一是生物学活性的检测，这类方法是利用细胞因子某一特定的生物学作用所设计的检测方法，如IL-2维持活化T细胞的增殖，IFN能保护病毒对正常细胞的感染，TNF-α选择性杀某些肿瘤细胞等，因此敏感性也较高；二是定量的检测，常用酶联免疫吸附试验(ELISA)，如多克隆抗体与单克隆抗体，识别不同表位两种单克隆抗体的双抗

2、体夹心法，生物学和定量的检测方法各有优缺点，在必要时可同时进行检测。　　　　　　一、白细胞介素1(IK-1)生物学活性测定　　白细胞介素1是一种重要的细胞因子，主要由单核-巨噬细胞产生，IL-1不仅对多种免疫活性细胞有重要的调节功能，而且与发热、炎症发生以及某些疾病的病理变化有关。目前对IL-1产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法。ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性　　(一)　原理　　小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达IL-1受体，在有IL-1同时存在的条件下，IL-1可协同丝裂原促T细胞的增殖作用。根据加

3、入IL-1后增殖水平(３H-TdR掺入率)的增加可计算出样品中IL-1的活性单位，或计算出刺激指数。　　(二)　操作步骤　　　　　　　　取6～8周龄C57BL16小鼠，拉颈处死，无菌取胸腺　　　　　　　　置不锈钢网筛上，用注射器针蕊研磨成细胞悬液　　　　　　　　调整细胞数为1.5×10７／ml　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　细胞悬液内加入ConA，使终浓度为3μg／ml，在96孔　　　　　　　　培养板中加100μl(1.5×10６细胞)　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　加入不同稀

4、释度待测样品和IL-1标准品　　　　　　　　100μl／孔(ConA终浓度为1.5μg／ml)　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　37℃CO２孵箱66h　　　　　　　　　　　　每孔加３H-TdR0.5μci　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓37℃CO孵箱6h　　　　　　　　多头细胞收集仪收获于9999型玻璃纤维纸上　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　烤干，移入液闪瓶中，加适量闪烁液，于液闪仪上测β计数　　计算:　　1.　从IL-1标准曲线上测得IL-1的活性单位　　2.　也可用刺激指数(SI)

5、表示　　　　　　　　　　　　　实验组cpm　　　　　　　　　　SI＝──────　×100％　　　　　　　　　　　　　对照组cpm(三)　试剂和器材　　1.10％FCSRPMI1640，96孔培养板，CO孵箱　　2.　标准IL-1，　ConA　　3.　３H-TdR，PPO、POPOP，二甲苯　　4.　9999型玻璃纤维滤纸，细胞收集仪　　5.　β液闪计数仪　　(四)　注意事项　　1.　不同品系小鼠对IL-1的反应性有差异，据国内资料报道以C57BL为好。　　2.　不同周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应性不一，一般选用6～8

6、周龄，小于5周或大于10周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应不稳定。　　3.　ConA促丝裂原作用要进行预试，一般采用亚适剂量。应用EL-4CTLL检测IL-1生物学活性　　IL-1是一种十分重要的免疫调节因子，同时也是一种可引起发热和导致多种病理损伤的重要的内源性致热原和炎症介质。目前IL-1检测方法有多种，主要包括：小鼠胸腺细胞法，黑素瘤细胞增殖抑制法，纤维母细胞法、T淋巴细胞系法以及EBV转化B细胞法等。　　㈠原理：小鼠胸腺瘤细胞系EL4的某些亚克隆细胞表面具有高密度IL-1受体，在IL-1诱导下产生高水平的IL-2，通

7、过用IL-2依赖株CTLL-2检测IL-2的生物学活性，从而反映检测样品中IL-1的水平。　　㈡操作步骤：　　　1.用EL４细胞两步法检测IL-1活性：　　　　　　　　收集处于对数生长期的EL４细胞　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　洗涤后，用1％FCSRPMI1640重悬细胞，并　　　　　　　　　　　调整细胞浓度2×10６/ml，　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　　加处96孔板中，100μl/孔　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　加入不同稀释度的IL-1α或IL-1β，100μ

8、l/孔，　　　　　　　　　　　同时设1％FCSRPMI1640对照　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　　　5％CO,37℃培养18～24小时　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　按终稀释度为1∶10～20转入另一块96孔板中　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　用CTLL-2检