流式细胞仪使用方案

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1、流式细胞仪使用方案一、单细胞悬液的制备贴壁细胞I0.25%胰蛋白酶消化2至3minI移至玻璃离心管I加入D-hank‘s液，轻轻吹打I用800-1000r/min离心机离心3至5minIf去上淸，加入PBS均匀吹打，短吋低速离心。』重复三次I加PBS充分吹打，保证细胞数每毫升1万个作川I加95%乙醇（1:10），固定30minI4度冰箱过夜或-20度长吋保存二、染色技术1选取荧光素荧光素激发光波长/nm发射光波长/nm1基本用途FITC488525抗原分了•检测PE488575抗取分子检测PE-TxRed488612抗原分子检测PerCP488677抗原分子检测PE-Cy5

2、/PE-Cy7488670/770抗原分子检测APC650660抗原分子检测APC-Cy7647774抗原分子检测CFSE488518细胞示踪与增值PKH26488567细胞示踪与增值CFP408475指示蛋白GFP488507指示蛋白YFP488527指示蛋白Hoechst33342350470DNA分析PI488620DNA分析7AAD546655细胞死亡TMRE550573线粒体膜电位FAM488525PCR定gFluo4488516游离的钙离子SNARF-AM488640细胞内pH2样品染色步骤PBS洗细胞1-2次I加荧光单抗，暗处孵育15-30minI如果必盂，加

3、災光二抗，暗处孵育15-30minIPBS洗细胞一次I过300目尼龙网I上机检测3对照的设置阴性对照同型对照（见附录）三、流式细胞数据处理与分析数裾的显示通常可分为一维单参数直方图（histogramplot）、二维点图（dotplot）、二维等高图（contour）和假三维图（pseudo3D）等。下而简述敁常用的单参数直方图和二维点图。1.单参数直方阁单参数直方图是一维数椐用得敁多的图形，可用来进行定性分析和定S分析。横蜥标表示荧光信号或散射光信号强度的相对值，其单位用“道数”（channel）表示，横啤标可以足线性的，也可以是对数的。纵少标通常代表细胞出现的频率或相对

4、细胞数。卜而以研究细胞周期为例说明如何分析单参数直方阁所表达的倍息。单参数直方图经DNA特兄性染料（如P1）染色的细胞群体，通过流式细胞仪测跫区受激光照射后发!li特界性荧光，在一定条件下，荧光强度与细胞内的DNA含跫成正比，DNA含跫高的细胞发射的荧光强，反之则弱。DNA含量与细胞数门的关系，即2N（2倍体）代表GO/G1期细胞，4N（4倍体）代农G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。这是典型的以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图。通过上述信息可得到所测细胞群中增殖细胞的数量。1.二维点阁单参数直方阁只能表明一个参数与细胞数量间的欠系，不能显示W个独立参数与细胞数量的关

5、系。当需耍研究两个或更多测量参数之间的又系时，讨采用二维点阁。二维点阁有两种形式，横坐标表示前內散射光（FSC）,反映细胞的大小；纵坐标表示侧句散射光，反映细胞内颗粒的人小和多少。坐标阁上每一点同时表示具有相疢坐标位的细抱存在。例如，人血A细胞悬液样品上机在坐标阁上根裾细胞人小和细胞内颗粒形态出现三类不同颜色的细胞群，通过设门框把这三类细胞区分丌，即红色显示淋巴细胞群（P1）,绿色M示单核细胞群（P2），蓝色显示中性粒细胞群（P3）。如果欲检测其中一种细胞W个独立参数与细胞数量之间的关系，则选定其中一个门框。假没选定淋巴细胞（P1）,即可对其M种不同荧光素标记的细胞数量进行

6、分析，岀现第二种形式的二维点閔。横坐标为PerCP-Cy5荧光标记的CD3细胞数鬥（荧光道数），纵坐标为FITC荧光记的CD4细胞数鬥（荧光道数）。因此，左上象限（Q1）代表CD4—细胞百分比，右上象限（Q2）代表CD4+/CD3-细胞百分比，左下象限（Q3）代表CD4—/CD3—细胞百分比，右下象限（Q4）代表CD3—细胞百分比。由此得知，在CD3+淋巴细胞屮CD4—淋巴细胞所片的百分比。I

7、I■II

8、IIII

9、VIII

10、IIII

11、I50100150200250FSCA(kI.OOWV-i----I•■--I-■■•I---•I25520O150IO0S0i•罾參'参:，

12、r費iihiIIiinniii"ii⑼io1ItrPrH^-Cy5-5-ATSII■■■I(P双指紐二维点M的细胞群框定荧光双染色二维点阁附:-、流式抗体选购常识由于在流式细胞实验过程屮，荧光抗体对羊细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质暈。因此，耑要考虑各种影响流式抗体品质及检测效果的因素，例如抗体特异性、荧光素信号强弱、荧光素細记方式、同型对照等。流式抗体的选择：1流式抗体本身也足抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择鉍葙木的条件：H标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。2流式抗体荧光标记的方式乜括直接标记和间