关于改良人源ll

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1、关于改良人源LL：杨艳丽,葛晓冬,刘友生,邹佳【人源杀菌肽LL　　FusionexpressionandbactericidalactivitiesofthereconstructedhumancathelicidinLL37　　【AbstractAIM:ToexpressandpurifythereconstructedLL37(rLL37)andstudyitsbactericidalactivity.METHODS:TheDNAsequenceofrLL37atographybinfectorXa.Then,byusing

2、highpositiveionexchangecolumnMacroPrepHighS,inedbythemeansofinhibitoryzone.RESULTS:TheDNAsequenceofrLL37aybefound.Then,therLL37eansofinhibitoryzonetobeabletokillbothGramnegativebacteriaandGrampositivebacteria.CONCLUSION:ItispossiblethattherLL37isexpressedinprocaryoti

3、ccellbyfusionanditpossessesastrongbactericidalactivity.　　【KeyancathelicidinLL37;fusionexpressionofprotein;bactericidalactivity　　【目的：将改良LL37多肽以融合肽形式表达、纯化，并初步探究其杀菌活性.方法：将编码改良的LL37多肽的DNA序列放进载体pET30a（+），转进工程菌BL21star(DE3)中，用IPTG诱导表达得到含6×His标记的改良融合蛋白LL37.再以TALON柱芯亲和层析、SDS

4、PAGE和acroPrepHighS纯化、收集各洗脱峰,脱盐、冻干.采用抑菌圈法检测改良LL37的抗菌活性.结果：改良的LL37多肽于载体pET30a（+）在杆菌BL21star(DE3)中高效融合表达，用凝胶扫描显示融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35％.融合蛋白经纯化后用SDSPAGE鉴定在Mr4000处见单一条带.经抑菌圈法检测改良的LL37多肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的杀菌力.结论：改良的人源性LL37多肽以原核细胞进行融合表达是可行的，并具有较强的杀菌活性.　　【人源杀菌肽LL37；蛋白质融合表达；杀菌活性

5、　　【中图号Ｑ７８　　0引言　　人类惟一的cathelicidingene所编码的蛋白质为hCAP18(humanCationicantimicrobialprotein18),LL37是Cthelincidin蛋白hCAP18C真个37个氨基酸片断,为Mr4.5×103的阳离子两性分子α螺旋抗菌肽，其氨基酸残基序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES［1-2］.LL37抗菌力较昆虫细胞源性抗菌肽的杀菌力弱.最新分离出恒河猴的同源蛋白RL37和LL37同源性很高,其净正电荷为+8,而LL3

6、7为+5.8，RL37的抗菌活性要高于LL37［3-4］.　　根据SAR（structureactivityrelationship）探究显示所有α螺旋抗菌肽的抗菌活性和抗菌普和肽链中所带正电荷、疏水性氨基酸数目密切相关，通过分子改造增加LL37肽链中正电荷的氨基酸和碱性氨基酸数目，而不改变其α螺旋构象来进步其抗菌活性是一种较好的途径［5-6］.本实验室对LL37进行改良，将Glu16,Asp26,Glu36分别替换为Gln16，Asn26，Gln36，净电荷由+5.8进步至+9.经PCR获得编码改良LL37的DNA全长基因片断

7、，并且所设计的DNA序列中其引导序列含有凝血因子Xa酶切位点和带负电荷的承载蛋白.我们通过构建适宜的表达载体、采用融合肽形式以大肠杆菌表达rLL37，将其克隆到含有6×His的特异亲和纯化标志序列的表达载体PET30a（+）中，从而在E.coli中表达出能被正确切割产生有抗菌活性的融合蛋白［7-8］.　　1材料和方法　　1.1材料BL21star菌、pET30a(+)，pMD18T和鼠抗6×HismAb购自ROCHE公司；DH5α菌由本探究所保存；ExTaq，SacⅠ，HindⅢ，Fxa裂解试剂盒购自TaKaRa公司；6×His

8、亲和纯化TALON柱芯及强离子交换柱芯MacroPrepHighS分别购自Clontech公司和BioRad公司；改良杀菌肽LL37的DNA序列为本所构建.　　1.2方法　　1.2.1rLL37多肽融合表达质粒的构建将本所已构建的改良杀菌肽LL37的DNA序列经