western-blot-教学

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1、蛋白质的电泳分析SDS-PAGE&WesternBlot蛋白组学平台提问：RT-PCR、WB、免疫组化、FCM、ELISA、Bio-plex用来检测什么？有何区别？SDS-PAGE蛋白分析的利器；Western既可以定性，又可以半定量,是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。WesternBlot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。是检测混合样品中单一特定蛋白的常用技术。灵敏度可以达到1-5pg.研究检测样品中特异性蛋白质的存在细胞中特异蛋白质的半定量分析蛋白质分子的相互作用研究WesternBlot应用蛋白样品制备SD

2、S-PAGE转膜抗体检测化学发光成像蛋白样品制备1蛋白抽提方法物理方法反复冻融机械搅拌超声研磨酶解法(裂解酶)化学方法自溶法去污剂总蛋白的提取材料：HT-29细胞（收集25cm培养瓶一瓶）试剂：RIPA蛋白抽提试剂（裂解液有多种，根据需要选择）检测beta-actin，分子量43KDa注意：为防止蛋白酶对蛋白的降解，提前前需加入1xcoaktail(含PMSF)，冰中操作。PMSF:丝氨酸蛋白酶抑制剂【配制方法】用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20℃。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。【注

3、意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。PMSF在水中不稳定，故需在使用前再加PMSF；PMSF低温时会有冰晶，用时要摇匀至无结晶。ProcedureforLysisofMonolayer-culturedMammalianCellsNote:Ifdesired,addproteaseandphosphataseinhibitorstotheRIPABufferimmediatelybeforeuse.1.Carefullyremove(decant)culturemediumfromadherentcells.2.Washcell

4、stwicewithcoldPBS.3.AddcoldRIPABuffertothecells.Use1mLofbufferper75cm2flaskcontaining5×106HeLaorA431cells.Keeponicefor5minutes,swirlingtheplateoccasionallyforuniformspreading.4.Gatherthelysatetoonesideusingacellscraper,collectthelysateandtransfertoamicrocentrifugetube.Centrifugesamplesat~1

5、4,000×gfor15minutestopelletthecelldebris.Note:Toincreaseyields,sonicatethepelletfor30secondswith50%pulse.5.Transfersupernatanttoanewtubeforfurtheranalysis.Protocol1、贴壁细胞，去培养基，加入2ml预冷的PBS，洗2-3次，最后移至EP管中，用滤纸弃干水分，25cm培养瓶一瓶加入120µL配好的含多种酶抑制剂的RIPA裂解液，用枪头轻轻将细胞吹散，放在冰上裂解20-30min，期间可以用手弹一弹管子或者振荡数次以使

6、细胞裂解充分。（注意不要引起过多气泡以免蛋白降解）。裂解完，14000转，4℃离心15分钟。取上清即得所需总蛋白。组织样品：按100mg组织加1ml的RIPA裂解液（含酶抑制剂），用玻璃匀浆器匀浆。冰中裂解，余同上。如果有些样品提时发现粘度较大（粘是因为含核酸多），可置于冰中进行超声数次；或者加核酸酶以降解核酸。提完蛋白请分装（分装时一定要保证蛋白混合均匀），-80℃保存备用。注意：不要全部变性，留些为变性的蛋白置于-80℃，以备用。如果是检测磷酸化蛋白则提取时要加磷酸酶抑制剂。方法灵敏度时间原理干扰物质说明双缩脲法灵敏度低中速，20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋生成紫色络

7、合物硫酸铵、Tris缓冲液、某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏快速，5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正；不消耗样品，测定后样品仍能回收利用Folin－酚试剂法（Lowry法）灵敏度高慢速，40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化;标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差考