流式细胞仪分析技术及应用

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1、第十一章流式细胞术主要内容数据的显示与分析1流式细胞仪的原理2流式细胞仪免疫分析的技术要求3流式细胞术在免疫检查中的应用4流式细胞术（flowcytometry，FCM）是以流式细胞仪作为检测工具，结合激光光学、计算机、电子物理学、流体力学、细胞化学和免疫学等学科的理论与技术，对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等第一节流式细胞术的分析及分选原理光学系统测试原理流式细胞仪电子系统液流系统光学原理光电转换原

2、理4激光光电倍增管放大电路流式细胞仪是集多种技术为一体的新型高科技仪器激光技术单克隆抗体技术细胞荧光化学技术光电测量技术电子物理技术电子计算机技术能对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选一、流式细胞仪分析的工作原理荧光显微镜技术单克隆抗体与荧光染料技术计算机技术处理光信号激发光源改为激光提高检测灵敏度和特异性提高检测速度和统计分析精确性（一）流式细胞仪基本结构包括流动室（flowchamber）和液流驱动系统作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区理想状态：细胞逐个

3、传送到激光束的中心，而且在特定的时间内，应该只有一个细胞或生物微粒通过激光束。1液流系统流动室和液流驱动系统流动室——仪器的核心部件，待测样品与激光在这里相交，通常由有机玻璃、光学玻璃或石英等制成。流动室内充满了鞘液，使细胞排成单列进入流动室喷嘴口，形成细胞液柱。FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管液流驱动系统：包括压缩空气泵、压力传感器、鞘液过滤器和样本压力调节器等。常用的液流系统中细胞流和鞘液流的驱动一般采用正压的方法控制的，保证了鞘液的流速恒定。鞘液以匀速通过流动室，因此整个液流系统运

4、行流速是不变的。包括激发光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管。流式细胞仪的测定是基于对光信号的检测来实现的，因此光学系统是流式细胞仪中最为重要的一个系统。2光学系统光学系统采用高压汞灯，廉价、激发光谱广泛，但在单一谱线上能量较弱，且功率不够稳定，应用受到一定限制弧光灯提供单波长、高能量、高稳定性的光照，是快速、准确分析细胞微弱光的理想光源。现代流式细胞仪多采用激光激光激发光源光学系统：主要由多组透镜、滤光片和分光镜等光学元件组成，将不同波长的光信号送入不同的探测器1）长通滤片（longpassfi

5、lter，LP)2）短通滤片（shortpassfilter，SP)3）带通滤片（bandpassfilter，BP）滤片长通滤片只允许特定波长以上的光通过，如LP500滤片，只允许500nm以上的光通过短通滤片与长通滤片正好相反，只允许特定波长以下的光通过，如SP500滤片，只允许500nm以下的光通过带通滤片只允许相当窄波长范围内的光通过，滤片一般有两个值，如BP500/50允许通过的波长范围为475～525nm，中心值为500nm。组成：光电转换器、放大器和信号处理电路作用：将产生的各种光信号成比例

6、的转换成电信号，进行数字化处理后转入电子计算机进行数据采集和分析。3电子系统高度聚焦激光束（二）基本工作原理单细胞悬液特异性荧光染料标记抗体染色流动室检测区恒定气压鞘液喷出高压细胞单行排列特异性荧光+散射光入射光束与液柱垂直方向前向小角方向荧光信号侧向散射光信号前向散射光信号荧光检测系统散射光检测系统前向散射光感受器光信号光信号电信号计算机系统转换放大二、细胞分选原理（一）分选的基本原理流式细胞仪的分选是指从细胞群体中分离出感兴趣的细胞，检测的任意参数都可作为分选时指定的细胞的依据。分选的方式有捕获式分选

7、和电荷式分选，目前应用最多的是电荷式分选。当单细胞悬液形成液柱通过流动室时，液柱被分割成一连串均匀的液滴。根据设定的被分选细胞的某个参数由逻辑电路判断是否被分选。电荷式分选1充电电路对选定细胞液滴充电，使其带正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细胞液滴则不带电荷。带电细胞液滴通过静电场而发生偏转，落入收集器中，其他液体则被当作废液抽吸掉，完成细胞分选的目的。电荷式分选2（二）FCM分选技术要求细胞分选对仪器的性能要求较高分选是流式细胞仪的重要功能之一分选功能的装置较为复杂分选指标分选速度分选纯度分选收获率每

8、秒可分离所要细胞的个数，一般要求分选速度至少达5000个/秒左右。分选纯度2分选速度1分选收获率3被分选出的细胞所占百分比，分选纯度与仪器配置和细胞是否重叠有关。被分选出来的细胞占应被分选的细胞的比例。通常情况下，分选纯度和收获率是相互矛盾。488nm激光+-前向散射光检测器荧光检测器电磁场单个细胞被分类进入检测管流式细胞仪分选系统第二节数据的显示与分析一、参数1、散射光信号：分为前向散射光（forwardscatter，FS