植物细胞工程实验(上课用)

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1、实验一、MS液体成份的配制一、实验目的：1、掌握植物组织培养常用MS液体培养基成份的配制技术；2、为后续组培实验做好准备工作。二、实验基本原理MS培养基是Murashige和Skoog（二人缩写）于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，其养分的数量和比例合适，是较稳定的离子平衡溶液，能满足植物细胞的营养和生理需要，适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。三、实验仪器与与试剂1、实验仪器：1000ml/500ml量筒4个、250ml三角瓶（每人2个）、1000ml烧

2、杯或塑料量杯5个、1000ml试剂瓶5个、10只100mL试剂瓶、微波炉、10ml离心管15个、玻璃棒5个、电子天平、称量纸、卷纸、移液枪（1000µL、100µL）、药勺。2、实验试剂：见下述实验方案中所列。四、实验方案与操作1、大量元素20X母液配制（贮备液I）配制20X（倍）浓度大量元素母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。KNO338g/LNH4NO333g/LKH2PO43.4g/LMgSO4.7H2O7.4g/LCaCl26.6g/L2、微量元素200X母液（贮备液II）配制：配制200X（

3、倍）浓度微量元素母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。KI0.166g/LH3BO31.24g/LMnSO4.H2O3.38g/LZnSO4.7H2O1.72g/LNa2MoO4.2H2O0.05g/LCuSO4.5H2O0.005g/L（先配母液：0.05g溶于10mL水中，再取1mL母液）CoCl2.6H2O0.005g/L（先配母液：0.05g溶于10mL水中，再取1mL母液）3、铁盐100X母液（贮备液III）---1000mL棕色瓶配制100X（倍）浓度铁盐母液1000mL，按顺序充分溶解后再

4、加后一个试剂。Na2EDTA.2H2O3.73g/LFeSO4.7H2O2.78g/L4、有机成分100X母液（贮备液IV）配制100X（倍）浓度有机母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。肌醇10g/L甘氨酸0.2g/L盐酸硫胺素(VB1)0.01g/L盐酸吡哆醇(VB6)0.05g/L烟酸(VB5)0.05g/L5、植物生长调节剂的配制：•0.1mg/mL的6-BA溶液：取0.02g的6-BA，用2mL1M的盐酸溶解，再加蒸馏水定容至200mL。•0.1mg/mLNAA：取0.02g的NAA，用2mL

5、95%乙醇或1N的NOH溶解后，再加水定容至200mL。五、实验注意事项1、配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。铁盐、有机物质配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它三种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月；2、配制铁盐中Na2EDTA.2H2O（酸性）时，pH值对其溶解度有重要影响，应逐渐加入固体NaOH使其刚溶解后，再与配好的FeSO4.7H2O溶液混合。六、作业：认真总结，完成本实验报告（将配制好的培养基瓶拍照，黑白打印粘贴在报告纸上）。实验二、

6、MS固体培养基的配制与灭菌一、实验目的1、掌握植物组织培养MS固体培养基的配制技术和灭菌方法；2、为后续外植物体接种和培养实验奠定前提基础。二、实验仪器与试剂1、实验仪器高压灭菌锅、微波炉、100-200个组培瓶、pH试纸、4个1000mL量筒、4个1000mL塑料量杯、4只玻璃棒、移液枪（1000µL、100µL）、称量纸、卷纸、电子天平、药勺2、实验试剂：10％NaOH、1MHCl、蔗糖，琼脂、70％酒精三、实验操作步骤1、称取6g蔗糖，琼脂粉1.6g，加入到500mL大烧杯中，再加入130mL双蒸水，混匀。2

7、、将烧杯在微波炉中加热煮沸3-5次，使溶液呈均匀、半透明稳定状态。3、无激素1/2MS液体成份的混合：按比例依次加入下列MS成份：大量元素20X母液微量元素200X母液铁盐100X母液有机成份100X母液5mL1mL2mL2mL每次加完后应充分混匀。观察有无沉淀，若无沉淀方可用。4、用10％NaOH调节pH至5.8（用pH试纸(5.4～7.0)不断检测pH值），补加双蒸水定容到200mL，充分混匀。5、将配好的1/2MS培养基趁热迅速分装至三角瓶中，每瓶倾倒20-30ml，用纱布和报纸包扎好，装入灭菌篮子（互相摆放

8、好，勿发生倾倒）。6、放入高压灭菌锅121℃，灭菌20min（整个过程约1.5h左右）。7、灭菌结束后，立即拿出瓶子，置于组培室架子或培养箱中观察3-7天，无菌落长出说明良好，供下步接种实验用。8、做好外植体接种准备工作：无菌水3000ml，无菌滤纸70张，无菌培养皿30个，镊子3把、酒精灯。四、作业：认真总结，完成本实验报告（将配制好的固体培养基瓶拍照，黑