无载体固定化酶生物催化

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1、【综述】无载体固定化酶的生物催化UlrichRoesslJozefNaha′lkaBerndNidetzky摘要首先回顾无载体不溶性酶的制备方法。交联酶聚集体技术现已用于大量的合成反应。在沉淀和交联所需但具有潜在致变性化学品缺失的情况下，融合蛋白会将目的酶的相对选择性聚集体或甚至其自组系统转为不溶性微粒，因而具有强劲的发展动力。在选定的生物转化中，用于多轮间歇式反应不溶蛋白颗粒的回收已经得到论证。然而，对于全连续生物催化过程应用来说，低耐机械应力和高压缩性依然是无载体酶颗粒所需要考虑的问题。关键词：生物催化

2、；无载体；固定化；交联酶聚集体；下拉域；自组系统引言不溶性酶制剂对于工业生物转化是一种有用的催化剂。与可溶性酶相比，不溶性酶更易于分离和循环利，且有利于连续过程的开发，因此往往是规模化生产操作过程的首选催化剂（Buchholz等，2005；Bommarius和Riebel，2005）。原本可溶性的酶通常将其附着在不溶性载体的表面，使其成为不可溶性酶，这个过程称为固定化（Cao等，2003；Cao，2005；Sheldon，2007a）。由于不同的可用载体和各种固定化策略，因此固定化方法在一般程序的基础上衍发

3、展了许多其他方法（Cao等，2003；Cao，2005）。将酶包埋在有机凝胶（Buchholz等，2005；Cao，2005）或无机凝胶（Betancor和Luckarift，2008）中，成为对载体介导固定化酶的一种特殊模式。关于载体约束不溶性酶，一个经常被提及的问题是，与基本制剂相比，其特异活性降低，但在可操作条件下可以提高其寿命和稳定性。尽管最近有一些相关方面的显著成果（Hanefeld等，2009），但现在依然不清楚固定化酶活性和稳定性增加或减少的分子依据。可惜的是，为优化催化性能而对酶固定化进行设

4、计时，在很大程度依然依靠经验经验（Sheldon，2007a）。固定化不溶性酶还有两个主的要缺点。大量的非催化物质（大约占生物催化剂总量的90%）被应用于固定化酶反应器，但是当所采用的酶特异活性很低的时候，就可能产生很严重的问题；此外，所采用的载体通常比要固定的酶价格更昂贵。因此，如果将酶沉淀制成不溶性颗粒，并且能很好地保留可溶性酶的特异活性，同时能有效地应对机械应力，这样就可以获得异种生物催化剂，而由固体载体产生的难题也可已部分消除。本文综述了无载体固定化酶方法的最新研究进展。根据酶蛋白聚合过程中生物的识

5、别和特异性，对所报道的的方法进行区分。交联酶聚集体制备固体制剂主要通过沉淀或结晶的方法。通常与双功能试剂相连接，如戊二醛，以使得在应用中来稳定不溶物，使之处于悬浮状态。交联酶晶体和聚集体已广泛地成功应用与生物催化。交联酶晶体方法（CLECs），出现于20世纪60年代（Quiocho和Richards，1964），已经应用到有限几种酶上，包括核糖核酸酶A，枯草杆菌酶，羧肽酶，乙醇脱氢酶及一些脂肪酶（Cao等，2003）。CLECs对于由加热、有机溶剂和蛋白质水解引起的变性，通常表现出良好的抗性（Sheldon

6、，2007b）。在某些情况下，可以通过改变结晶和交联的条件，来调节结晶大小和剩余特异活性（Margolin，1996年）。通过鼻疽菌脂肪酶已经表明，以表面活性剂或β-环糊精为CLECs涂层，可以进一步提高酶使用寿命和操作稳定性（Rajan和Abraham，2008年）。当前CLEC技术使用范围主要受到（纯）酶成功结晶需求的限制。不溶性催化剂也可以在溶液中直接交联进行制备（CLEs）。但是由此产生的酶制剂很难处理，并且具有机械不稳定性。沉淀要求许多工艺参数的微妙平衡（蛋白质和交联剂浓度、pH值、温度、离子强度

7、、混合等），因此通常是不可再现的（Cao等，2003）。认识到CLECs和CLEs的局限性后，Cao等人（2000年）提出交联酶聚集体技术，并对其进行商业化（http://www.cleatechnologies.com）。原本的缩写CLEA，现在也已登记为商标名称。CLEAs最初用于青霉素G酰化酶，随后应用于大量其他酶（如脂肪酶，蛋白酶，酰胺酶，酯酶，植酸酶，氧氰酶）。制备CLEAs的一般程序涉及酶（微）聚集体或多酶结合体的盐诱导或溶剂诱导，然后通过化学交联得到稳定的全蛋白沉淀。例如，硫酸铵，叔丁基酒精或

8、聚乙二醇有助于引起青霉素G酰化酶的聚集。同样根据所采用的特定酶要求，交联试剂也会有所不同（Mateo等，2004；Kuba'c等，2008），但最常用的还是戊二醛。CLEAs很适合于有机溶剂中的生物催化（Cao等，2000）。两种或更多的酶原则上可以共同聚合，形成所谓的CLEAs化合物（Mateo等，2006）。含有果胶酶、木聚糖酶和纤维素酶活性的CLEAs化合物制剂便是一个显著的成功例子（Dalal等，2007