基因表达检测---rt-pcr

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1、基因表达检测第三部分:RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)ReverseTranscriptionPCRRNA抽提cDNA反转录基因特异性引导Oligo(dT)引导随机六核苷酸引物引导PCRNorthernBlotting基因表达分析NorthernBlottingAwardedNobelPrizeforChemistryin1993.基因表达水平(梁大成等,2006)表达增强克隆的RT-PCR和Northern杂交分析ladderc1357c1357c1357c1357c1357EI12I1EI22F2

2、2EI1K8EI35I3ß-actinABCDEA:IRBB10叶片接种白叶枯(PXO86)C:C101A51叶接种稻瘟病(V86013)B:IRBB13叶片接种白叶枯(PXO99)D:MH63叶片接种稻瘟病(V86013)E:MH63叶片接种稻瘟病(1366)(周斌,2001,硕士论文)mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR,RT-PCR比Northern杂交更灵敏,对RNA的质量要求较低,操作简便,它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。实验原理被污染的试剂,缓冲液移液器使用的器皿及tip等

3、操作者的手,头发等RNA操作中应注意的问题:防止RNase污染外源RNase的主要来源:当处理RNA时,移液器专用保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用;溶液和试剂分装成小份保存;RNA电泳装置专用(清洗、处理、DEPC处理过的水冲洗);防止外源RNase污染的主要措施(一):准备所有的溶液和缓冲液时,使用无RNA酶的玻璃器皿,DEPC处理过的水,用于RNA的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离,可能的话,用0.1%的DEPC在37ºC处理溶液1小时后在15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。18

4、0-300ºC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品;使用新的、无RNA酶的一次性tubes,tips等;在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性。防止外源RNase污染的主要措施(二):材料要新鲜;裂解过程要同RNase活性抑制同步防止内源RNA酶降解RNARNA酶抑制剂RNA酶是一种很顽固的酶,在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有:DEPC氧钒核糖核苷复合物RNA酶的蛋白质抑制剂DEPC:是高度活性的烷基化试剂,通过组胺

5、基团乙氧基甲酸化形式破坏RNase的活性OCCOO-CH2-CH3-CH2-CH3氧钒核糖核苷复合物:能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制RNA酶的活性RNA酶蛋白质抑制剂RibonucleaseInhibitor可与RNase形成非共价的复合物,从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。RNAEXTRACTION(miniprep)RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和cDNA的合成都是必须的,RNA的纯度和完整性对于Northernblot,RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生

6、物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多,最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染。实验目的:学习RNA的简易制备过程,通过RNA电泳带评价RNA质量实验材料:水稻幼嫩叶片苯酚/氯仿反复抽提,价廉但质不优,尤其是对多酚等含量高的材料不适蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法强变性剂法。硫氰酸胍,盐酸胍等,可配合氯化铯离心或有机溶剂提取。TrizolReagent提取方法:利用Trizol试剂抽提植物总RNATrizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂,在匀浆和裂解过程中,能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保

7、持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后,RNA处于水相中,将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少,可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA,体外翻译和分子克隆等。75%乙醇(inDEPC-treatedwater)氯仿异丙醇(RNA专用)RNase-freewater:DrawwatertoRNase-freeglassbottles.Adddiethylpyrocarbonate(DEPC)to0.1%.Letstandovernightandautoclave.防止外源

8、RNase的污染:应戴口罩和手套,环境洁净;玻璃器皿180ºC烘烤3hrs以上;塑料制品DEPC水清洗,蛋白质变性剂处理;一次性用品如tube,tip等使用新的,无RNA酶的产品。RNA抽提前应准备的其它试剂及物品:操作步骤(一)液氮磨样,每管分装

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