生化实验教案

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1、t物化嗲实發fT?实验三离子交換柱层析法分离氨基酸Ge!filtrMtonHydrophobicinceraaionIonexchangeAffinuyReversedphase华肀科技大嗲i命科嗲与技水嗲淀2012级i物化含小名师第三狙离子交换柱层析法分离氨基酸【实验目的】1.学习离子交挽树脂分离氨基酸的基本原理。2.掌握离子交换柱层析的基本操作。3.掌握氨基酸和茚三酮S色机理。【实验原理】1.离子交换层析原理离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离R的的方法。有些高分子物质含有一些可以解离的基团，例如-S03H,-COOH

2、等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应，如：这类高分子物质统称为离子交换剂，离子交换剂是一类具有离子交换功能的商分子材料。功能基团由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，二者所带电荷相反，以静电作用结合。可进行交换的离子称为反离子或抗衡离子，这种反离子可与溶液中带同种电荷的离子进行交换反应。因离子交换反应是可逆的，在一定条件下被交换的离子也可以“解吸”，使离子交换剂乂恢到原来的离子形式，所以离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。其屮使用的最普遍的是离子交换树脂。巾于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子

3、交换柱上的迁移速度也不同，最后完企分离。选择适当的条件，可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质则不能被交换，这两类物质即被分离。带同种电荷的不同离子都可以结合到同一介质上，但由于各A所带电U:不同，与介质的结合牢度不同，可改变洗脱条件使它们依次先后被洗脱，从而达到分离目的。离子交换层析是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法。本实验采用磺酸型阳离子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp,pI2.97）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。氨基酸是两性电解质，分子上所带的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH

4、值。在pH5.3条件下，因为pH值低于Lys的PI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在pH12条件下，因pH值高于Lys的pi值Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下來。这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。1.茚三酮反应机理茚三酮反应是指在加热条件下，氨某酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与羟脯氨酸或脯氨酸反应生成（亮黄色）化合物的反应。该紫色化合物在570nm处有最大光吸收，所以可以利用分光光度计测量其含量。由于该反应灵敏度高，目前已经广泛应用于氨基酸定性和定量的分析，国内的大部分教材认为

5、其反应机理为：OS基酸茚三胡K基骏1i印三的反炖但是大量实验表明而且大部分的学者认为茚三酮显色反应生成的有色物质是混合物而不是单一组分。茚三酮显色反应受pH，茚三酮试剂的配制方法和浓度，氨基酸种类和浓度，反应温度，反应时间，冷却时间，离子强度等都有较人影响。特别要注意的是pH对显色反应的影响特别大，且该反应在一个小时A稳定。【实验器材和试剂】一、实验器材层析柱（20cm*lcm）；铁架台；恒流泵；部分收集器；分光光度计；移液枪；恒温水浴锅；试管；玻璃棒；烧杯；试管架。二、实验试剂①732型阳离子交换树脂（100-200目）②2mol/L氢氧化钠溶液，1mol/

6、L氢氧化钠溶液；③2mol/L盐酸溶液，0.1mol/L盐酸溶液；④紐准氨基酸溶液天冬氨酸、赖氨酸均配制成2mg/mL的0.1mol/L盐酸溶液；⑤洗脱液柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液（pH5.3）取柠檬酸14.25g,氢氧化钠9.30g和浓盐酸5.25mL溶于少:W:水后，定容至500mL,冰箱保存注：在拧檬酸缓冲液中加入0.1%酚溶液可防止长霉。在室温较高的夏季，配制缓冲溶液川的蒸馏水必须是新鲜蒸馏水，配前煮沸，配好后在4°C保存。0.01mol/LNaOH溶液（pH12）取（）.4gNaOH固体用适量蒸馏水溶解后，定容至1L⑥显色剂取0.5g茚三酮溶于7

7、5mL乙二醇单甲醚巾，加水定容至lOOmL。待测样品混合氨基酸溶液：将2mg/mL天冬氨酸、赖氨酸溶液按L2.5的比例混合，混合后再以kl的比例用O.lmol/L盐酸溶液稀释。［操作步骤］1.树脂的处理对于市售干树脂，先是经水充分溶胀后，经浮选得到颗粒大小合适的树脂，然后加4倍量的2mol/LHCl溶液浸泡1小时，倾去酸液，川蒸馏水洗至巾性，然后川2mol/LNaOH溶液处理，做法同上。以Imol/LNaOH溶液浸泡树脂一小吋转化为钠型，用蒸馏水洗至中性，最后用欲使用的柠檬酸缓冲液浸泡，过剩的树脂浸入Imol/LNaOH溶液中保存，以防细菌生长。2装柱取层析柱

8、一支，垂直固定在铁架台上，（实验前耑进