产甲壳素酶菌株的筛选与诱变

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1、产甲壳素酶菌株的筛选与诱变夏祥，吕梦圆，罗玲，蔡俊，胡瑛（湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室／工业发酵湖北省协同创新中心，武汉４３００６８）摘要：以胶体甲壳素作为惟一碳源，从自然界微生物中筛选并诱导到一株产甲壳素酶活性较高的菌株，经１６ＳｒＤＮＡ鉴定为Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．。并以该菌株作为出发菌株，经过一次紫外诱变，酶活是初筛菌株的１．４８倍。再经过二次紫外诱变或者紫外－ＬｉＣｌ复合诱变，酶活分别是初筛菌株的３．１６和３．８７倍，最高酶活达到３．４８Ｕ／ｍＬ。最后通过连续传代培养，确定了菌株ＨＭＸ－１６经过紫外和复合诱变后突变性状稳定性良好

2、。..关键词：甲壳素酶；紫外诱变；紫外－ＬｉＣｌ复合诱变；产酶活性中图分类号：Ｑ９３－３３１；Ｑ９３３文献标识码：Ａ：０４３９－８１１４（２０１５）０５－１０６２－０４ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０５．００９收稿日期：２０１４－１２－１６基金项目：湖北工业大学高层次人才启动项目（ＢＳＱＤ０８１３）；２０１３年全国大学生创新创业训练计划项目（２０１２１０５０００３０）简介：夏祥（１９８８－），男，安徽淮北人，在读硕士研究生，研究方向为生物可再生资源的利用和发酵工程，（）１５６０８６４３３３１（电子

3、信箱）９０５６３３２１６＠ｑｑ．ｃｏｍ；通信，胡瑛（１９７５－），女，副教授，主要从事再生资源生物利用和生物活性物质的生物转化研究，（电子信箱）ｈｕｙｉｎｇ＠ｍａｉｌ．ｈｂｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ。甲壳素作为一种结构多糖在自然界分布广泛，广泛存在于甲壳动物的外壳、节肢动物的骨骼以及真菌和藻类的细胞壁中，是地球上除纤维素外的二大生物资源，也是保健食品、医用材料和化妆品工业的重要原料［１，２］。由于甲壳素分子很大，分子之间存在强烈的分子间和分子内氢键作用，很难溶于酸、碱和一般的有机溶剂，从而大大限制了甲壳素的应用。和大分子甲壳素相比，甲壳低聚糖无毒、易被

4、人体吸收，并具有抗肿瘤、增强免疫力、抗菌、降胆固醇、保湿及促进植物抗逆生长等多种生理功能，在食品、医药、农业等领域有着广泛的应用前景，成为近年来的研究热点［３］。酶法生产甲壳低聚糖具有条件温和、水解反应易于控制、不造成环境污染等优点，特别是专一性酶亲和力强，选择性高，产品质量好，所以，采用酶法降解甲壳素一直是目前国内外研究的热点［４］。但目前专一性甲壳素酶价格昂贵，活性较低，难以商品化，因此寻求高活性的产甲壳素酶菌株仍是目前甲壳低聚糖研究和应用开发的关键［５］。甲壳素酶（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ，ＥＣ．３．２．１．１４）是一类能催化降解甲壳素β－１，

5、４？蛳糖苷键的水解酶，可以根据其酶切位置不同，分为内切甲壳素酶和外切甲壳素酶，外切甲壳素酶可分为甲壳二糖酶和Ｎ－乙酰氨基葡萄糖酶。甲壳素酶广泛存在于动物、植物以及微生物（细菌、放线菌、真菌）中［６］，据统计，迄今已发现约５０个属近１００种甲壳素酶产生菌［７－９］，在植物病虫害防治和甲壳素生物资源利用等领域有广泛的应用前景。目前，虽然已经从多种微生物中分离出甲壳素酶，但大多数产酶能力都较低。而诱变育种是筛选菌株最常用的方式之一［１０，１１］。紫外线辐照是一种较为常用的物理诱变方式，操作方便、安全，没有化学诱变剂毒性，对原核生物而言是一种比较好的诱

6、变因素。氯化锂是一种碱金属卤化物，单独使用是一种弱诱变剂，但可协同作用来提高诱变效果。本研究采用透明圈法从自然界微生物中筛选到一株产甲壳素酶活性较高的菌株，采用物理诱变、复合诱变处理，最后通过连续传代培养，筛选出一株产甲壳素酶活性较高并稳定性良好的菌株。１材料与方法１．１材料１．１．１菌株与仪器菌株于湖北省所取得的土样，所用试剂均为分析级。超净工作台（ＳＷ－ＣＪ－１Ｄ型，苏州净化设备有限公司）、恒温培养箱（ＨＰ３００ＧＳ－Ｃ型智能人工气候箱，武汉瑞华仪器有限责任公司）、离心机（ＴＧ１６－１１型高速离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司）、分光光度计（

7、ＷＦＪ２０００型分光光度计，上海智城分析仪器制造有限责任公司）。１．１．２１０ｇ／Ｌ胶体甲壳素制备称取商用甲壳素２０ｇ，溶于１３０ｍＬ５０％的硫酸中，用玻璃棒搅拌均匀，放置于４℃冰箱溶解２ｄ。完全溶解后，过滤除去杂质。加入３倍以上体积的无水乙醇。４℃醇沉过夜，用去离子水洗涤，８０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，去掉多余的水分，再洗涤直至ｐＨ６．５，最后用去离子水定容到２Ｌ［１２］。１．１．３培养基１０ｇ／Ｌ胶体甲壳素和含其他培养基成分的水溶液分开灭菌，使用前等体积混合。１）富集培养基：最终浓度为甲壳素５ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４０．７ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ

8、４０．３ｇ／Ｌ，酵母粉５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·7H2O０．５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４１０ｇ／Ｌ，去离子水１０００ｍＬ，ｐＨ７．０。２