凋亡相关蛋白apr

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1、凋亡相关蛋白Apr　　【Abstract】AIM:Tocloneandexpresstheapoptosisrelatedprotein2(Apr2)fromthemodeloftheapoptosiscellsofHL60.METHODS:ThemodelofapoptosiscellsofHL60thecellsandmRNAplifytheapr2codingregionandthePCRproducted.SDSPAGEshoedtoestimatethepercentageoftherebinantp

2、roteininthetotalbacteriaprotein,inaryexpressionproductoffusionproteinhasbeenobtained,provedsubtractivehybirdization,ISH）克隆出了10个凋亡相关新基因，并在GenBank中登录，其中凋亡相关蛋白Apr2的生化性质、结构、功能以及与凋亡的确切关系还不清楚，国内外文献尚无研究报道.我们利用HL60细胞凋亡模型，对Apr2基因编码区进行克隆、表达及序列分析，为进一步研究Apr2的结构功能及制备多克隆抗

3、体奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料HL60细胞系、大肠杆菌DH5α由本实验室保存;PGEMTEasy及iniPrepsDNAPurificationsystem购自Promega公司；PGEX4T2购自Pharmacia公司;TRIzol总RNA提取试剂盒购自GibcobrlLifeTechnology公司;TaKaRaRNALAPCRKit(AMV)逆转录PCR试剂盒、限制性内切酶XhoⅠ，BamHI，T4DNA连接酶购自TaKaRaBiotech公司；RPMI1640购自华美生物制品有限公司;新生小

4、牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；GeneRulerTM100bpDNALadder及GeneRulerTM100bpDNALadderplus购自Fermentas公司.　　1.2方法　　1.2.1引物设计与合成以GenBank中人HL60cDNA编码区序列（ACCESSION：AF143236）为模板，设计引物，序列如下：5′GGATCCATGGTTTCCTTGTGGGTG；3′CTCGAGTTAATCCCAAACGGTGGCTG；并在上游引物中加入BamHI酶切位点，在下游引物中加入XhoⅠ酶切位点

5、(下划线部分为酶切位点).引物由上海生工生物工程有限公司合成.　　1.2.2HL60细胞凋亡模型的建立［2,3］将处于对数生长期的HL60细胞稀释至5×106个・mL-1，加入1mmol・L-1ATRA（全反式维甲酸）2μL，使培养液中ATRA终浓度为1μmol・L-1，培养12h后收集细胞.　　1.2.3RTPCR取约5×106个HL60凋亡细胞，按TRIzol总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,取5μL用紫外分光光度仪测定样品浓度.提取的RNA逆转录合成cDNA，

6、取上述引物，进行PCR扩增.反应参数为：95℃预变性5min，95℃50s；55℃30s；72℃30s；共30个循环，72℃延伸5min；4℃保存.取PCR反应产物5μL，10g・L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定.　　1.2.4Apr2克隆载体的构建参照文献［4，5］，PCR产物经电泳鉴定后，试剂盒回收目的片段，并与PGEMTEasy连接，转化E.coliDH5α,利用氨苄青霉素抗性筛选重组克隆.提取阳性克隆的质粒DNA，进行BamHI和XhoⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定.初步鉴定正确的重组克隆对其进行序

7、列分析.　　1.2.5Apr2重组表达载体的构建将用BamHI，XhoⅠ双酶切纯化后的目的cDNAapr2亚克隆到经同样双酶切后的载体PGEX4T2中，质粒与插入DNA的克分子数比为1∶3，得到的重组表达质粒PGEX4T2/apr2.经BamHI和XhoⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定.　　1.2.6Apr2编码区cDNA在E.coli的表达［6］将表达载体PGEX4T2/apr2转化感受态E.coli，在含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上过夜，次日挑选一个单菌落接种LB液体培养基中过夜，取100μL摇起的菌液加

8、至5mL新鲜LB培养基中37℃，2.5h后，取1mL菌液做诱导前对照，余加入5μL0.42mol・L-1的异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）诱导3h后,进行150g・L-1SDSPAGE,分析目的蛋白质的表达情况.　　　　1.2.7样品的大量制备及初步纯化吸取菌液按1∶100接种新鲜LB液体培养基中扩大培养，方法同上.诱导后菌液离心，保留沉淀，加Tris&#