wb注意事项及常见问题

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1、WB注意事项及常见问题注意事项一、样本收集1.组织样本原则上耍求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管（根裾实验的需要告知他们取多少组织），并加入适量裂解液和研磨珠，然后放置于-8（rc保存。具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；2.细胞样品原则上耍求客户或我们的技术员不耍用胰酶把细胞消化下来，特别是分选对象是膜蛋0时，具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”；二、总蛋白提取1.组织样品具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋a时，记得加入磷酸化酶抑制剂；2.细胞样品具体详情参照“细胞样品收集注意事项.

2、doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋a时，记得加入磷酸化酶抑制剂；三、蛋白样本保存裂解细胞或组织提取总蛋白吋，细胞碎片沉淀一般-20°C保存以防万一，提取好的蛋ITJ样品分装2份，一份加入上样缓冲液变性后-20°C保存，一份直接-20°C保存；四、蛋0变性提取好的总蛋0取一部分（不是全部）加入上样缓冲液进行加热变性（IOO°C,5min）,变性好的蛋白应该-20°C保存，冻融后不再需要加热变性；五、SDS-PAGE1.浓缩胶的胶浓度一般为5%,用于压沉样品；1.分离胶的胶浓度取决于分析对象的分子景大小，详情见WesternBlotting全攻略.p

3、df第4页;2.分离胶和浓缩胶的高度比为8:3;3.电泳结朿后，应及吋用清洗干净玻璃板，清洗吋应使用海绵檫布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；4.电泳结束后，应及时冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀；5.清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝；六、转膜1.注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的转印方向；2.注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的相对大小，以免造成短路;3.转印结束后，应及时取出转印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入封闭液，这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题：4.转印结束厄，应及时冲洗

4、转印槽和转印芯，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀；5.转印结朿后，应及吋用水泡洗海绵垫和滤纸，以免盐离子沉积，导致转膜吋短路，并放在篮子上晾干，如果海绵垫和滤纸不及时晾干，容易导致海绵垫和滤纸N部的结构破坏；七、封闭1.进行封闭时，应加入足量的封闭液（以完全覆盖膜为底限），并保证整个封闭过程屮，膜与封闭液充分接触，避免长时间离丌封闭液，特别进行4°C静止封闭过夜时，一定耍加入足量的封闭液和保证平坦放置；上述注意事项主耍为了避免膜变干，导致背景升高；八、一抗杂交1.一抗的稀释比例：第一次使用时参考其体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实际的实验结果进行调整；2.杂交条件：

5、如果是室温孵育，至少保证孵育1-2小吋，并放置脱色摇床上进行摇晃，如果是4°C孵育，应孵育过夜，可静止亦可放置脱色摇床上进行摇1.应使用专用的一抗稀释液进行稀释，使用U进行回收并4°C保存，如粜回收的稀释抗体用沉淀或长菌，应丢弃；九、一抗杂交后洗膜1.-般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高,可以把NaCl的浓度提高到500nM（标准的为150nM）;2.一般洗涤3次，每次lOmin,如果判断因为是一抗的原因导致的竹景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次；十、二抗杂交1.二抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实

6、际的实验结果进行调整；2.杂交条件：一般室温孵育，孵育1小时即可（时间延长会产生非特异杂交，从而导致背景过高），并放置脱色摇床上进行摇晃（一定要避免膜变干，否则背景其高）；3.应使用封闭液进行稀释，使用后进行不冋收；二抗杂交后洗1.一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把NaCl的浓度提高到500nM（标准的为150nM）;2.—般洗涤3次，每次lOmin，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次；十二、拍照1.注意选择曝光时间，同时兼顾工作效率，因选择连续拍照模式，这样总冇一个何时曝光时间；十三、报告

7、单整理1.原始阁片：2.对比度和亮度调整的图片；3.图片说明：上样顺序；4.灰度值：原始值，数据标准化（同•个样品的口标蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值），相对表达量（实验样品的数据标准化比值除以参照样品（问客户）的数据标准化比值），参照样品的相对表达量一定为h1.实验方法：准确的一抗，二抗，稀释比例；常见问题一、没信号1.膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无条带：实验失败？抗体失效？；重新进行实验，重新稀释抗体；2.膜_片空白，没冇任何条带，阳性对照样品冇条带：实验样品降解？实验样品无该蛋白的表达？转膜效率过低？；重新进行实验，复核查找上述原因，以寻找对