β肌动蛋白的克隆与鉴定

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1、P肌动蛋白的克隆与鉴定王鹏邓志康石绮峰刘允刘准刘斌摘要：肌动蛋白是在真核生物中普遍存在的一种古老的蛋內质之一。P肌动蛋白是肌动蛋白家族的一员，广泛表达于真核生物非肌细胞中，是构成细胞骨架的维持、细胞运动、细胞分裂等。作为一种细胞质肌动蛋a,e肌动蛋g在所有组织屮相对持续稳定表达，因此e肌动蛋白基因常用作定量研究的对照基因。由管家基闵的旮份决定，p肌动蛋內基因的启动子为强启动了，对于提高转®因表达具冇显著的效果，其表达不受组织的限制。关键词：P肌动蛋白克隆分析一材料与方法1.1组织DNA的提取1.

2、1.1材料细胞裂解缓冲液蛋白酶KTE缓冲液酚:氯仿:异戊位(25:24:1)1.1.2过程1.取新鲜或冰冻动物组织块0.lg，尽量剪碎，置于玻璃匀浆器中，加入ImL的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5mL离心管中，加入蛋白酶K20mL，混均，在65°C恒温水浴锅中水浴20min，间歇振荡离心管数次，于台式离心机以12000rpm离心5min,取上淸液入另一个离心管中。2.加2倍体积异丙醇，倒转混均后，可以看到丝状物，用100mL吸头挑出，晾干，用200mlTE重新溶解。3.加等量的酚：氯

3、仿；异戊醇振荡混均离心12000rpm,5分钟4.取上层溶液至另一试管加入1/2体积的7.5mol/L乙酸铵，加入2倍体积的无水乙醇，混均后室温沉淀2分钟，离心12000rpm,10分钟。1.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上将附于管壁上的残余液滴除掉。2.用lml70%乙醇洗涤沉淀物离心12000rpm,5分钟。3.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上将附于管壁上的残余液滴除掉。4.加200mlTE重新溶解沉淀物，然后置于4°C或20°C保存备用。1.2PCR1.2.1过程配制25毫升反

4、应体系在PCR板屮依次加入模板DNAluL下游引物，PCR预混液12.5uLddH2O9.5uL设置PCR反应体系程序94°C532个循环94°C30s55°C30$72°CIs72°C10s上样，启动反应程序,扩增产物的产物检测1.3电泳1.3.1材料50xTAE缓冲液lxTAE缓冲液溴化乙啶欵存液6x上样缓冲液DNA样品DNALadder掠脂糖1.3.2过程制备1%琼脂糖凝胶:称取1.5g琼脂糖置于锥形瓶中，假如150mlTAE，瓶!■!倒扣小烧杯100°C加热煮沸3次，摇匀，即成1.0%琼

5、脂糖凝胶。胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽洗干净，晾干，放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃与内槽两端边缘封好，形成模子将冷却到65°C左冇的琼脂糖凝胶混匀小心倒入内槽，形成均匀胶层。加样：在点样板伤感混合DNA样品和上样缓冲液。电泳：加样后的凝胶立即通电进行电泳，加压110V，样品由负极向正极方向移动。观察照相：在紫外灯T观察，DNA存在则显绿色荧光带，拍照保存。1.4连接1.4.1过程与T载体连接（PUD-18T）PUD-18T取0.5-l.Ou，冋收纯化的DNA2u（或3_4u）看具体浓度加

6、水互补至5u1再加入5u1solutionI（冰上助融）共10u1在16QC放置30min之后4°C过液转化：大肠杆菌（DH5a）1.从-70°C冰箱屮去除感受态细胞，放入冰水屮融化，放置大约lOmin2.用冷却后无菌吸头将连接好的I）NA混合液加入到感受态细胞中（没100P1感受态细胞加连接产物5Pl）轻旋转，混匀内容物，在冰上放置30min3.再将离心管放到42°C的水浴锅中热激90s切勿摇动试管4.迅速转移到冰浴屮，使细胞冷却l_2min5.每管加400u1的LB液体培养基，转移到37°C

7、摇床上，温浴45min转速不超过125转，使细胞复苏（一般得4-5H菌液xl*能浑浊）摇完后4000rpm离心2-3min，弃去上清200ul，使菌液浓度增加，用枪吹打后，再涂平板（此步可在4°C保存）6.涂平板，尽量迅速至菌液被吸收，如吸收不完全正放30min之后倒放在37QC培养箱过液1.5转化1.3.1过程从-70°C冰箱屮取出感受态细胞，放入冰水屮融化，大概放置lOmin;用冷却的无菌吸头将连接好的DNA混合液加入到感受态细胞中（没100PL感受态细胞加连接产物5PL）轻轻旋转，混匀内容

8、物，在冰上放置30min；再将离心管放到42°C的水浴锅中热激90s，切勿摇动离心管；迅速转移到冰浴中，使细胞冷却l_2min;每管加400uL的LB液体培养基，转移到37°C摇床上125转，使细胞复苏，摇完后4000rpm离心3min,弃去上清液200uL,然后用枪吹打后涂平板，37°C培养箱中过夜；用枪头挑单菌落接于5mL液体LB培养基中，摇12h后提取质粒。用EcoRI和Hindlll进行质粒双酶切或PCR鉴定1.6质粒DNA的提取1.6.1材料1.X-gal（5-溴-4-氯-3卩引啜-3