护骨素基因启动子区t149 c基因型和等位基因频

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1、护骨素基因启动子区T149C基因型和等位基因频【摘要】目的:探讨绝经后汉族妇女护骨素(OPG)基因启动子区T149C基因型和等位基因频率在中国大陆不同区域存在的分布差异.方法:用聚合酶链反应限制性片断长度多态性（PCRRELP）测定随机选取的89例西安市绝经后正常妇女和72例广州市绝经后正常妇女OPG基因T149C的基因型.结果:所选人群OPG基因T149C基因型频率分布在两地绝经正常妇女中均符合Hardyentlengthpolymorphism,RFLP)分析技术对绝经后中国大陆不同区域的汉族妇女OPG基因启动子T149C多态性进行分

2、析,以期了解其基因型和等位基因频率在中国大陆不同区域是否存在着分布差异.1对象和方法1.1对象组Ⅰ为89例在陕西西安市居住10a以上,平均年龄63.2（49~79）岁的绝经后正常妇女，组Ⅱ为72例在广东广州市居住10a以上，平均年龄62.8（46~77）岁的绝经后正常妇女，彼此无亲缘关系,自然绝经时间超过5a.同时不具有以下情况的汉族妇女作为研究对象，即除外甲亢、甲旁亢、糖尿病、皮质醇增多症、多发性骨髓瘤等所致的骨质疏松症患者，除外类风湿性关节炎、恶性肿瘤、消化道疾病及动脉粥样硬化患者，近期使用VD、钙剂、降钙素、雌激素及激素替代药物等影响骨代谢的药物

3、的妇女.调查和取样均征得受试者本人同意.1.2方法1.2.1引物设计与合成引物按GenBank网站(编号:AB008821)和文献［3］提供的OPG基因启动子序列,用PrimerPremier5软件设计,引物序列为:上游引物5′CTGGAGACATATAACTTGAACA3′,下游引物,5′CCATCATCAAACCCCTATTGGT3′(上海生物工程公司合成),特异性扩增产物的片段为300bp.1.2.2DNA的提取外周静脉血2mL,肝素抗凝,采用TaRaKa公司的试剂盒从全血中提取基因组DNA,提取的DNA溶于TE缓冲液,-20℃保存备用.

4、1.2.3PCRRFLP反应PCR反应体系为20μL,其中基因组DNA0.2μg;10×ExTaq扩增缓冲液;上、下游引物各0.2μmol/L;dNTP各200μmol/L;ExTaqDNA聚合酶1U,PCR反应程序:95℃预变性10min后进行热循环.每个循环条件是:94℃热变性1min,51℃复性4s,72℃延伸1min,共进行38个循环,循环完成后再于72℃延伸8min.5μL反应产物于15g/L的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察扩增是否成功.扩增产物为300bp,取3个样本测序确认，其余经15g/L琼脂糖凝胶电泳确定后，取PCR产物加过量的限制性

5、内切酶XbaⅠ经37℃消化后,在25g/L琼脂糖凝胶中分离酶解产物，紫外灯下确定基因型.统计学处理:采用SPSS11.0统计软件.χ2检验判断OPG基因启动子区T149基因型是否符合HardyWeinberg遗传平衡定律.2结果134例受试者经序列分析后在OPG基因启动子区找到了单核苷酸多态性T149C位点(图1).两组实验对象均检测到TT型、CC型和CT型三种基因型，存在XbaⅠ酶切位点的纯合子TT,显示153bp和147bp两条带;缺乏XbaⅠ酶切位点的野生型纯合子CC,显示300bp一条带;杂合子TC则显示上述三条带(图2).OPG基

6、因启动子区T149C基因型和等位基因频率分布见表1,其等位基因在组I和组II中的频率分布符合HardyWeinberg遗传平衡定律,经χ2检验组Ⅰ与组Ⅱ绝经后正常妇女基因启动子区T149C基因型分布有统计学意义(χ2=70.41,P=0.000).图1OPG基因启动子区单核苷酸多态性T149C位点（箭头所示）3讨论骨质疏松症是一种多因素病症,它的发生是多因素的结果，该病的骨量降低是环境因素和遗传因素共同作用的结果，即便在相同生理环境下，是否发病仍存在着个体差异.近年来遗传因素日益受到重视，它在骨质疏松的发生中占50%~70%［2］.在双生子和家

7、系的研究中显示,85%骨密度的差异是由遗传因素所决定的［2,4］.OPG是近年发现的一种骨代谢分泌性调节蛋白,其在调节骨代谢方面的重要性已经被证实.目前多组研究发现OPG基因启动子和内含子多态性主要与下列位点有关:T149C,A163G,G209A,T245G,C889T,T950C,G1181C,A6890C.研究发现,163,209,245和1181位点与腰椎骨密度降低或骨折相关［4］.许多国家对这些部位的基因多态性与绝经后骨质疏松及老年性骨质疏松的骨量和骨代谢指标的相关性进行了研究,结果各不相同.本研究结果显示：西安市和广州市16

8、1名绝经后汉族妇女OPG基因启动子区T149C多态性等位基因频率分布符合HardyWeib