缺血后处理对肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织细胞凋亡及

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1、缺血后处理对肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织细胞凋亡及【摘要】目的：观察缺血后处理(IPo)对大鼠肾缺血再灌注(I/R)损伤后肾组织细胞凋亡及bcl2和bax基因表达的影响，并探讨其肾保护的机制.方法：18只雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组（S组），缺血再灌注组（I/R组），缺血后处理组（IPo组）,每组6只.采用夹闭双侧肾蒂45min,再灌注6h制备肾脏缺血再灌注模型.IPo组在夹闭双侧肾蒂45min后，再灌注10s，缺血10s，反复3次，再全面恢复血液灌注.再灌注6h时处死大鼠，酶法测定血清肌酐（Cr）含量;苦味酸不除蛋白法测定尿素氮（BUN）含量;采用逆转录－多聚酶链反应（RT

2、PCR）检测肾组织bcl2mRNA和baxmRNA表达，表达水平以与其相应的内参βactin的光密度比表示；原位末端脱氧核苷酸转移酶标记（TUNEL）法检测肾组织中凋亡细胞，计算细胞凋亡指数（AI）；苏木素伊红（HE）染色，在光镜下观察肾组织病理学变化.结果：与S组比较，I/R组肾组织Cr和BUN浓度升高（P<0.05），bcl2mRNA表达量降低（P<0.05），baxmRNA表达量升高（P<0.05），bcl2mRNA/baxmRNA的比值降低（P<0.05），AI增加（P<0.05），组织形态学观察可见肾小管上皮细胞水肿，变性坏死，肾小管

3、扩张，间质淤血、水肿、大量中性粒细胞浸润.与I/R组相比，IPo组肾组织Cr和BUN浓度降低（P<0.05），bcl2mRNA表达量升高（P<0.05），baxmRNA表达量降低（P<0.05），bcl2mRNA/baxmRNA的比值升高（P<0.05），AI减少（P<0.05），肾组织形态学损伤减轻.结论：缺血后处理可减轻肾脏I/R损伤，其肾保护作用可能与其上调bcl2基因和下调bax基因表达，使bcl2mRNA/baxmRNA比值升高，从而抑制缺血再灌注损伤后的肾组织细胞凋亡有关.【关键词】肾再灌注损伤细胞凋亡基因bcl2缺血后处理0引言缺

4、血后处理（ischemicpostconditioning，IPo）可减轻心肌缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)损伤［1-2］，还可减轻脑［3］、肝［4］及肠的I/R损伤.本课题的前期研究发现IPo可以抑制肾I/R损伤诱发的肾组织细胞凋亡，具有一定的肾保护作用，但是抑制凋亡的的具体机制有待探讨.细胞凋亡是基因控制的细胞主动死亡过程，目前认为至少有两类基因与凋亡调控有关，以bcl2为代表的抗凋亡基因和以bax为代表的促凋亡基因共同调节细胞凋亡.本研究观察了IPo对大鼠肾I/R损伤后肾组织细胞凋亡及bcl2和bax基因表达的影响，并探讨IPo的肾保护机制.

5、1材料和方法1.1材料健康雄性SD大鼠18只，体质量250～280g，由河北省实验动物中心提供，随机分为3组：假手术组（S组），缺血再灌注组（I/R组），缺血后处理组（IPo组），每组6只.术前禁食12h，自由饮水.大鼠腹腔注射100g/L水合氯醛300mg/kg麻醉后，将大鼠仰卧位四肢固定于鼠台上，行腹正中切口，钝性分离肾包膜，显露和游离肾脏，仔细分离肾蒂，保护输尿管，用无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂，肾脏颜色变为暗红色即可确认肾脏血流阻断，造成双侧肾缺血45min后，显露肾脏，松开动脉夹,肾脏由暗红色恢复鲜红色即可确认血流恢复，逐层缝合腹部正中切口.再灌注6h即为肾缺血再灌注模型.夹闭

6、和放开肾蒂时腹腔内各注射林格液20mL/kg.S组仅行开腹，游离出双侧肾脏，分离双侧肾蒂不夹闭，伤口用生理盐水纱布覆盖，暴露45min不作肾缺血处理；IPo组夹闭双侧肾蒂45min后，再灌注10s，缺血10s，反复3次，再全面恢复血液灌注6h.1.2方法1.2.1标本制备再灌注后6h,过量麻醉剂下经心脏抽血迅速处死动物.将血液标本注入离心管，静置30min，2500r/min离心15min,提取血清标本，-70℃冰箱保存待测.在无菌条件下，迅速摘取左肾，分装入1.5mL离心管，液氮冻存，用于进行PTPCR.取右肾，40g/L多聚甲醛固定，制备石蜡切片，4℃保存待用.1.2.2血清C

7、r,BUN含量的测定应用SelectraE全自动生化分析仪（Vital，荷兰）酶法测定血清Cr水平，苦味酸不除蛋白法测定BUN含量.1.2.3肾组织bcl2mRNA和baxmRNA表达的测定取50～100mg标本匀浆后，Trizol试剂提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度计检测法测定RNA含量，取等量RNA逆转录合成cDNA，以βactin为内参照，扩增bcl2,bax和βactin，所有引物均由上海生物工程公司合成.引物序