荧光定量taqman技术在检测乙肝病毒dna中的

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1、荧光定量Taqman技术在检测乙肝病毒DNA中的【摘要】目的：探讨荧光定量Taqman技术检测乙肝病毒（HBV）感染者乙肝病毒脱氧核糖核苷酸（HBVDNA）的临床意义，以及与乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝e抗原（HBeAg）的相关性。方法：采用荧光定量Taqman技术对76例乙肝感染者HBVDNA的检测。结果：在76例标本中，HBVDNA的阳性率为42.1%，HBsAg的阳性率为75.0%，HBeAg的阳性率为17.1%。结论：HBsAg、HBeAg反映HBV的复制状态存在局限性，HBVDNA定量检测是反映HBV复制和药物疗效的判断最直接可靠的指标

2、。【关键词】乙肝病毒；荧光定量Taqman技术；应用　　荧光定量Taqman技术是一种新的基因定量检测技术，该技术实现了核酸扩增(PCR)从定性到定量的飞跃，融会了PCR的高灵敏性，DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，有效地解决了其他方法很难处理的PCR污染的问题，尤其在检测乙肝病毒DNA（HBVDNA）中的应用越来越受重视［1］。本文结合血清学指标乙肝两对半，初步探讨荧光定量Taqman技术在检测HBVDNA中的临床价值。　　1材料与方法　　1.1标本乙型肝炎血清标本来自本院住院和门诊患者；正常血清标本来自本院输血科。用一次性试管收集血液

3、，分离血清，置-40℃保存或立即检测。　　1.2荧光定量Taqman技术检测　　1.2.1仪器与试剂仪器采用德国RocheDiagnosticsGmbH公司的LightCyclePCR扩增仪。试剂采用上海克隆生物高技术有限公司乙型肝炎病毒（HBV）PCR荧光定量检测试剂盒。　　1.2.2技术原理荧光定量PCR法采用了先进的Taqman荧光探针技术，其试剂比常规PCR试剂多了一个寡聚核苷酸探针，这个探针带有一个荧光发光分子和一个荧光淬灭分子，完整的探针在激光下，发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收，样品无荧光，而PCR扩增中，Taq酶在链延长过程中，可通过自

4、身的5'3'核酸外切酶活性降解与模板结合的特异性荧光探针，使荧光发光分子与淬灭分子分开，从而在激光下产生特定波长的荧光，这种荧光随着PCR扩增过程呈动态增强，可以检测到一个荧光增长曲线，通过测定荧光强度可进行起始模板的定量分析［2~4］。　　1.3标本、对照品的处理血清标本，试剂盒阳性、阴性对照各取100μl（冻存血清或对照品使用前在室温融解，振荡混匀10s），分别加入100μl核酸提取液A，振荡混匀10s，13000r/min离心10min，弃上清；分别加入25μl核酸提取液B至沉淀中（核酸提取液B使用时一定要充分混匀，边振荡边将颗粒和液体一起加入沉淀中

5、，其中颗粒量应在15%以内），振荡混匀10s，100℃沸水浴10min，13000r/min离心2min。处理后的样品应在1h内使用，或在-20℃~-80℃最长保存1个月（不宜反复冻融）。　　1.4试剂准备、加样和PCR扩增　　1.4.1试剂准备按样品数n取HBVPCR缓冲液n×18μl、MgCl2n×3μl、HBV荧光探针n×3μl、Taq酶n×2μl混于一离心管中，旋涡振荡器上振荡混匀10s，低速离心数秒，按每管26μl分装。　　1.4.2加样将样品处理上清液（冻存样品使用前室温充分融化，振荡混匀数秒，13000r/min离心2min）和定量校准品（使用

6、前应先离心，再充分振荡混匀）1号~4号各4μl分别加入反应管中，混匀后分别取20μl移入专用毛细管中，低速离心数秒后置入LightCycle，立即进行PCR扩增反应。　　1.4.3PCR扩增反应管先在50℃反应1min，然后94℃保温2min，再按93℃3s~60℃30s循环40次。　　2结果　　2.1乙肝两对半和荧光定量Taqman技术检测结果比较乙肝两对半检测的HBsAg的阳性率显著高于HBeAg和荧光定量Taqman技术检测HBVDNA的阳性率（HBVDNA含量>4.2×102copy/ml），而HBVDNA的阳性率要高于HBeAg的阳性率

7、，见表1。　　表1HBVDNA、HBsAg、HBeAg的阳性率的比较（略）　　2.2乙肝两对半检测的HBsAg与HBeAg及荧光定量Taqman技术检测HBVDNA的比较HBsAg为阳性的患者的HBVDNA和HBeAg可能为阳性，也有可能为阴性,其中HBVDNA阳性率为52.6%（30/57），HBeAg阳性率为22.8%（13/57）；HBsAg为阴性的患者其HBVDNA和HBeAg一般都为阴性，但也有少数例外，检测中有2例HBsAg和HBeAg都为阴性而HBVDNA却为阳性。　　2.3乙肝两对半检测的HBeAg与HBsAg及荧光定量Taqma

8、n技术检测HBVDNA的比较HBeAg为阳性的患者