生化试验报告

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1、2013年生物化学实验B实验报告姓名：易顺学号：201145009实验时间：2013年11月9日实验分组：第6组组内成员：练伟平（201144402）黄皓辉（201144406）李雨霖（201144407）任课教师：李晓晖小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定考马斯亮蓝法测定蛋白质含量SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量易顺化工1101摘要碱性磷酸酶广泛存测定在于动物脏器，微生物和植物中，本实验具体介绍怎样从小牛肠中提取碱性磷酸酶，利用考马斯亮蓝法测定期中蛋白质含量及酶的活性；通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量关键词小牛肠碱性磷酸酶、酶活测定、考马斯亮蓝

2、法、SDS-聚丙烯凝胶电泳碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,EC3.1.3.1,AKP)是一种非特异性磷酸单酯水解酶,能催化多种磷酸单酯类化合物的水解从而得到相应的醇。AKP广泛存在于动物各脏器、微生物和植物中。本实验拟通过刮去、离心、析出等方式提取小牛肠碱性磷酸酶，从而测定其酶的活性。目前测定蛋白质含量的常用方法主要有凯氏定氮法、考马斯亮蓝(CBB)染色法、紫外分光光度法、双缩脲法、Folin-酚试剂法(Lowry法),其次双辛可宁酸(BCA)法、银染法、荧光法(灵敏度一般较低)的报道。有关文献报道CBB法优于其他的方法[3]。鉴于文献报道CBB染色法

3、与其它方法相比,具有消耗蛋白质量小、灵敏度高、受外界因素影响小的优点,下面采用CBB染色法测定蛋白质含量。Shapiro[4]于1967年首次报告了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，根据他对11种蛋白质电泳获得的结果，发现蛋白质（或亚基)分子量的对数与蛋白质分子的迁移率之间有直线关系。Weber[5]等人的深入研究，肯定了Shapiro的发现，确立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的新方法。Shapiro和Weber所应用的SDS-凝胶电泳缓冲系统为连续的磷酸盐系统，后来Laemmli[6]将SDS电泳和DaVis[7]的不连续盘状电泳结合起来，设计出不连续的S

4、DS-Tris-甘氨酸系统，此系统具有很好的浓缩效应，分辨率比磷酸系统更髙应用更为广泛。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种用作测定蛋白质分子量常用的生物化学实验方法。它的基本原理是SDS与蛋白质分子结合，形成复合物。而且各种蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中迁移率只与蛋白质的分子量有关系，因此电泳迁移率就取决于蛋白质分子的大小。用这种方法测定蛋白质的分子量，操作简便，快速，所需设备廉价，所得结果在分子量为15KD-200KD的范围内，与其他方法测得的分子量相比，误差一般在+10%以内。本实验用这种方法测定给定蛋白质样品的相对分子质量。1实验部分1.1试剂与仪器1.试剂(2):

5、平衡缓冲液（0.01mol/LTris-HCl,pH0.8,含1.0x10-3mol/LMgCl2和1.0x10-5mol/LZnCl2）(3):底物缓冲液：1mol/L二乙醇胺-盐酸缓冲液。（pH9.8）(4):酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15x10-3mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液。(5):分离胶缓冲溶液：1.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.8，已加入10%SDS。(7):浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH6.8，已加入10%SDS。(8):上样缓冲液：100mgSDS、2mg溴酚蓝、2g甘油，0.1mL巯基乙醇、2mL0.05m

6、ol/LpH8.0Tris-HCl，加超纯水定容至10mL。(9):染色液：含0.1%考马斯亮蓝R250，40%甲醇和10%冰醋酸的染色液500mL，过滤后备用。(10):脱色液：500mL10%甲醇和10%冰醋酸的脱色液1000mL。(11):电泳缓冲液；考马斯亮蓝；生理盐水。2.仪器1000W，220V.AC电子万用炉（北京市永光明医疗仪器厂）；DYY-8C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；eppendorf5804R型冷冻离心机；JYL-350A型匀浆机（九阳公司）；UV762型紫外可见光分光光度计（棱光）；WD-9405A型脱色摇床（北京市六一仪器厂）；GSY—2型恒

7、温水浴1.2实验过程1.聚丙烯凝胶的制备1）.装板2）.制备分离胶：小烧杯中按下表配置所需浓度的分离胶分离胶制备（浓度10%，制备量10mL）试剂用量H2O4.1mL30%丙烯酰胺3.4mL1.5mol/LTris-HCl缓冲液pH8.82.4mL10%过硫酸铵100μLTEMED10μL3）.制备浓缩胶：小烧杯中按下表配置所需浓度的浓缩胶：浓缩胶制备（浓度5%，制备量6mL）试剂用量H2O3.4mL30%丙烯酰胺1.0mL0.5mol/LTris-HCl缓冲液pH6.81.5mL10%过硫酸铵60μLTEMED8μL4）.蛋