《细胞免疫荧光》word版

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1、简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.437度PBS2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥10分钟3.PBS洗净:3min＊34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2＊5min6.羊血清封闭：３７度，２０分钟７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度　１－２小时８.４度　PBS洗净，３min＊５次９.二抗　３７度小于一小时１０.３７度　PBS洗净，３＊５min　　凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）　　活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、　　　　　

2、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)　　　　　　　　的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl1∶20(用DPBS　　　　　　　　稀释)灭活正常兔血清　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃30min　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　

3、　　　　　　弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠　　　　　　　　　(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4℃30min　　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入　　　　　　　　　1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，　　　　　　　　　视细胞浓度加入100～500μl固定液)　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　FCM检测或制片后荧光显微镜下观察　　　　　　　　　　(标本在试管中可保

4、存5～7天)（二）试剂和器材　　1.　各种特异性单克隆抗体。　　2.　荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。　　3.　10％FCSRPMI1640,DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。　　4.　玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。（三）注意事项　　1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。　　2.　洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。　　3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。　　4.　细胞活性要好，否则易发生非特异

5、性荧光染色。　　附:　　1.DPBS(×10,贮存液)　　　　NaCl80g　　　　KCl2g　　　　　蒸馏水加至1000ml　　　　Na２HPO４11.5g临用时用蒸馏水1∶10稀释　　　　KH２PO４2g　　2.　洗涤液　　　　DPBS　　　　　　900ml　　　　FCS50ml(终浓度　5％)　　　　4％NaN３???50ml(终浓度0.2％)　　3.　固定液　　　　DPBS　　　　1000ml　　　　葡萄糖　　　　20g(终浓度2％)　　　　甲　醛　　　　10ml　　　　NaN３　　　0.2g(终浓度0.02％)我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35m

6、m或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。2.4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。3.0.2％TritonX－100通透10分钟，PBS洗三遍。4.与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。5.一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。7.最好用DAPI染核，然后直接照

7、荧光片。8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。