外源精氨酸对不同诱导型一氧化氮合酶表达程度的胃癌

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1、外源精氨酸对不同诱导型一氧化氮合酶表达程度的胃癌【摘要】目的探讨诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达与外源精氨酸补充对胃癌细胞生长的影响。方法RTPCR法检测胃癌细胞株SGC7901及MGC803中精氨酸酶Ⅰ、Ⅱ(AⅠ、AⅡ)及iNOS的mRNA表达，MTT法检测分别培养于富/无精氨酸培养基的SGC7901及MGC803胃癌细胞株的生长情况，及加入1μmol/LNOS抑制剂L单甲基精氨酸(LMMA)后的生长变化。结果iNOS在胃癌细胞株MGC803强表达，但在胃癌细胞株SGC7901表达极弱；2种细胞株A

2、Ⅱ均强表达而AⅠ无表达。无论是否存在LMMA，富精氨酸培养条件下胃癌细胞株SGC7901的增殖均强于无精氨酸时(P<0.05)，而在富/无精氨酸培养基中，是否加入LMMA均不影响胃癌细胞株SGC7901的增殖(P>0.05)。无LMMA时，胃癌细胞株MGC803在富精氨酸培养条件下的增殖强于无精氨酸时(P<0.05)；在无精氨酸培养基中加入LMMA不影响细胞生长(P>0.05)；但在富精氨酸培养基加入LMMA可显著促进胃癌细胞株MGC803生长(P<0.05)。结论外源精氨酸补充对

3、iNOS高表达的胃癌细胞可能因iNOS产物的增加而产生细胞抑制作用，精氨酸耗竭策略可能更适合低表达iNOS的肿瘤细胞。【关键词】精氨酸；一氧化氮合酶；胃肿瘤；肿瘤细胞，培养的精氨酸是鸟氨酸循环中精氨酸酶完成氨解毒、合成多胺的唯一底物。精氨酸酶有2种亚型，Ⅰ型为肝精氨酸酶(hepaticarginase,AⅠ)，存在于肝细胞质；Ⅱ型为肝外精氨酸酶(extrahepaticarginase,AⅡ)，存在于线粒体基质。精氨酸同时也是一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)合成NO的唯一底物[1]。在胃癌

4、组织中，诱导型NOS（induciblenitricoxidesynthase,iNOS）的高表达已为人所熟知，而高精氨酸酶活性亦很常见[25]。对不同乳腺癌细胞株的研究表明，精氨酸酶活性越高细胞增殖越快，而iNOS活性高时则相反，这主要是由于精氨酸酶高活性增加了细胞增殖所需的多胺合成，而iNOS活性高时增加的产物NO则明显抑制细胞生长[6]。为探讨这一现象是否同样存在于胃癌组织中，笔者检测不同iNOS表达程度的胃癌细胞株在富/无精氨酸培养基中的生长情况及与iNOS抑制剂L单甲基精氨酸(Lmonomethylar

5、ginine,LMMA)的关系，探讨iNOS表达与外源精氨酸补充对胃癌细胞生长的影响。1材料与方法1.1细胞培养胃癌细胞株SGC7901及MGC803为福建医科大学神经解剖研究室保存。细胞复苏后，以含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基(美国Gibco公司)，37℃、体积分数为0.05的CO2恒湿培养箱培养。1.2方法1.2.1条件培养基无精氨酸培养基为不加入精氨酸的RPMI1640培养基，富精氨酸培养基为加入2mmol/L精氨酸的

6、RPMI1640培养基。1.2.2RTPCR检测不同细胞中，AI、AⅡ、iNOS以及βactin（内参照）的基因表达采用RTPCR方法。以Trizol(美国LifeTechnologies公司)法抽提总RNA，SuperscriptⅡ试剂盒(美国Invitrogen公司)合成cDNA。按说明书操作。PCR引物序列如下：AI（278bp）上游：5’ATCACAGCAAACCGAACAGAAC3’下游：5’TTCCAACCGTGAGTTGACACTT3’AⅡ（302bp）上游：5’GAGGCTTTCTAT

7、GTTGGGATGC3’下游：5’CTGATACAGTGGTGAGGGGTGT3’iNOS（324bp）上游：5’CCTTCAGGTATGCGGTATTTGG3’下游：5’TGCTGAGAGCTTTGTTGAGGTC3’反应条件分别为：AI，94℃30s→62℃45s→72℃45s，28个循环；AⅡ，94℃30s→58℃45s→72℃45s，30个循环；iNOS，94℃30s→60℃45s→72℃45s，28个循环。βactin(490bp)为参照。RTPCR分析重复3次，扩增产物用20g/L琼脂糖凝

8、胶电泳，凝胶成像仪记录灰度，以目标基因产物与βactin的灰度比值(x±s)为mRNA相对表达量，结果取平均值。1.2.3MTT法检测细胞生长情况胃癌细胞株SGC7901及MGC803于含10%FCS培养基的96孔板生长至50%～60%融合，分别加入最终浓度1μmol/L的LMMA（美国Sigma公司）[7]。各设4组复孔。