酵母rna的提取及组份鉴定与核酸的定量测定

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1、实验酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定【课前预习】1.为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？2．如何从酵母中提取到较纯的RNA?3．干扰RNA的提取的物质有哪些并设计排除这些干扰的实验。4．干扰紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度实验的物质有哪些？【目的要求】1.了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。2.了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。3.学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。【基本原理】由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组

2、织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后,上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5

3、利用等电点沉淀。酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法

4、操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。核酸摩尔消光系数及相应光吸收值ε(P)含磷量/(%)A260nmpH7，260nm1μg/mLRNA7700-78009.50.022-0.024DNA-Na盐66009.20.02（小牛胸腺）蛋白质也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nmx吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质

5、含量较高时，比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法先除去。【实验用品】1.试剂1)0.04MNaOH溶液；2)95%乙醇；1.5M硫酸；3)浓氨水；4)0.1M硝酸银；5)酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mLHCl；6)三氯化铁浓盐溶液：将2mL10％三氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液加入400mL浓HCl；7)苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于95％乙醇100mL。8)定磷试剂：（1）17％硫酸：将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中；（2）2

6、.5％鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100mL水中；（3）10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL水，棕色并保存溶液；临用时将三种溶液和水按下列比例混合：17％硫酸：2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）。9)钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。10)5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。11)钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.2

7、5%钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。12)5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。1.测试样品干酵母粉。2.器材移液管0.2mL（×1），0.5mL（×2），1mL（×4），2mL（×4）；滴管；容量瓶50mL（×3）；量筒10mL（×1）；离心机；分光光度计；冰浴；水浴锅。【方法步骤】1.酵母RNA提取称5g干酵母粉悬浮于30mL0.04MNaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入10mL酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置

8、，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次。再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算。2.RNA组份鉴定取2g提取的核酸，加入1.5M硫酸10mL,沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。1)嘌呤碱：取水解液1mL加入过量浓氨