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《植物基因组dna的提取及其定性定量分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、《分子生物学》实验报告实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析【实验目的】通过木实验学习利用CTAB法从植物组织屮提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。【实验原理】CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下（大于0.7MNaCl），与蛋白和屮性多糖形成合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。琼脂糖凝胶电泳是分离和
2、纯化DNA片段的常川技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液屮带负电荷，在电场屮向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶屮泳动吋有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数的双链DNA儿乎具有等馑的净电荷，因此，在一定的电场强度不，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快
3、，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA（cccDNA0）^最快,其次为线状DNA（LDNA）,最慢的为幵环质粒DNA（ocDNA）e核酸分子（DNA或RNA＞由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供丫基础。1OD260相当于dsDNA50ng/mL，ssDNA33pg/mL和ssRNA40pg/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不
4、但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0,则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。【仪器、材料与试剂】一、仪器及耗材离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器（10、100、1000gL量程各一支）、100mL或250mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5m
5、LEP管、PE手套和乳胶手套。二、药品三羟甲基氨基甲烷（Tris）、CTAB（
6、•六烷基三甲基溴化铵）、p-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠（NaCl）、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。三、试剂1.2xCTABbuffer[1]2.70%乙醇【2】3.RNaseA（天根｝【3】4.0.5XTBE缓冲液（工作浓度＞[1]5.6xloadingbuffer6.核酸染料（赛百盛）7.DNAmarkerDL2000（Takara）8.酚/氯仿（1:1,V/V）Ifl
7、【实验步骤】1.取约100mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5mLEP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。2.加入0.6mL2xCTAB提取液（用前加入0.2%的巯基乙醇），混匀，65°C水浴30min,每10min颠倒混匀一次。3.収出离心管，冷却后加入0.6mL酚氯仿混合液，混匀。4.11,500rpm室温离心8min（若没离好可重复一次）。5.将上清液（约400
8、iL）转移到另一新的1.5mL离心管中。6.加入与上清等体积的氯仿，混匀，ll,500rpm离心8min，取上清（约350gL）。7.加入600
9、
10、iL无水乙醇，上下颠倒混匀，-80°C^^i30min。8.4°C,15,800rpm离心20min，弃上清。9.ImL70%乙醇（预冷）洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能vortex,7,000g离心3min,弃上清，风干。10.加入30pL无菌水（含20pg/mLRNaseA），37°C溶角早DNA30min。11.取5pLDNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：（1）制备琼脂糖凝胶称取0.3g琼脂糖，放入三角瓶屮，加入30mL0.5xTBE缓冲液，置微波炉屮加热至完全熔化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液
11、。（2）胶板的制备①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙），形成一个模具。②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。③待琼脂糖凝胶液冷却到60°C左右时，加入核酸染料1.5叫，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶而（注意不要形成气泡）。④室温下静置直至凝胶完企凝固（室温下30-45min）,垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。⑤加
