雷公藤内酯醇对tca 8113细胞增殖周期进程的影响

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1、雷公藤内酯醇对Tca8113细胞增殖周期进程的影响【摘要】　　目的观察雷公藤内酯醇（TL）对体外培养的人舌癌细胞系Tca8113细胞诱导分化机制，为人舌癌治疗提供理论依据。方法应用噻唑蓝（MTT）比色法检测不同浓度的TL对Tca8113细胞的增殖抑制率，相差显微镜观察细胞形态学改变，流式细胞仪检测Tca8113细胞周期进程改变及凋亡率，电子显微镜观察经TL作用后的Tca8113细胞超微结构改变。结果TL对Tca8113细胞的增殖抑制率呈明显的剂量依赖性，相差显微镜下实验组细胞贴壁不佳，并且数目减少，细胞圆缩。流式细胞仪结果显示G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞增多，细胞

2、凋亡率升高。电子显微镜下可见细胞高度空化，线粒体肿胀，细胞核染色质趋边，可见凋亡小体。结论TL对Tca8113细胞有显著的增殖抑制作用，阻止Tca8113细胞G1期向S期转化进程，诱导Tca8113细胞凋亡及亚细胞结构改变。【关键词】Tca8113细胞；雷公藤内酯醇；细胞周期；凋亡　　近年来研究发现雷公藤内酯醇（tritolide，TL）对于人与动物多种肿瘤细胞在体内外具有较强的抗肿瘤作用〔1〕。但对头颈部肿瘤的作用尚未见报道。本研究观察不同浓度的TL对舌癌Tca8113细胞增殖周期各时相的影响及凋亡率，为人舌癌的治疗提供理论依据。　　1材料与方法　　1.1细胞及试剂　　Tca8

3、113细胞(北京医科大学口腔医院)；噻唑蓝（MTT）及RPMI1640培养基(美国Sigma公司)，TL(中国药品检测所)，胎牛血清(长春生物制品研究所)。　　1.2方法　　1.2.1MTT比色法　　取对数生长期的Tca8113细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，调细胞数为2×105/ml，接种于96孔塑料培养板内，每孔100μl，当细胞增殖达到80%汇合时分组，分别加入1、3、5μg/mlTL溶液，每个浓度10复孔，同时设空白对照组，静止培养24h，于结束前6h加入MTT试剂20μl/孔，终浓度为500mg/L，继续培养6h后，吸弃上清，加入二甲基亚砜（DMSO）150μl/孔，振

4、荡10min，使MTT还原产物完全溶解，酶标仪于570nm处测定各孔吸光度A值，按公式计算Tca8113细胞增殖抑制率：Tca8113细胞抑制率＝（1-加药组细胞A值/对照组细胞A值）×100%　　1.2.2流式细胞术　　细胞培养及分组同1.2.1，不同之处是将96孔培养板改为25ml培养瓶进行，培养结束后经0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，PBS洗2次，70%冷乙醇固定，上机前调细胞数为1×106/ml，PI染色，流式细胞仪检测，细胞周期结果以Modifi2.0软件分析。　　1.2.3透射电镜　　细胞培养及分组同1.2.2，分别收集经不同浓度TL作用的Tca8113细胞，移入锥

5、型离心管内，离心弃上清，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，环氧树脂包理，超薄切片，醋酸铅铀双重染色，透射电镜观察并拍照。　　1.3统计学处理　　所有实验数据以x±s表示，采用SPPS11.0软件，细胞生长抑制率组间比较采用χ2检验，细胞周期比值组间比较用F检验。　　2结果　　2.1不同浓度TL对Tca8113细胞增殖的抑制作用　　TL可明显抑制Tca8113细胞的增殖，不同浓度的TL与Tca8113细胞共孵育24h后，相差显微镜可见对照组细胞生长旺盛，细胞发亮，折光性强，而实验组细胞圆缩，贴壁不佳，细胞数目变少，且随着药物浓度的升高细胞改变越明显，具有显著的剂量依赖性。显示

6、不同浓度的TL对Tca8113细胞增殖抑制率均有影响，组间比较差异显著。见表1。不同浓度TL对Tca8113细胞周期各时相均有影响，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，凋亡率上升，组间比较差异显著。见表2。表1不同浓度的TL对Tca8113细胞增殖抑制率的影响(略)表2不同浓度的TL对Tca8113细胞周期各时相及凋亡率的影响(略)　　2.2不同浓度TL对Tca8113细胞超微结构改变　　见图1。1μg/mlTL诱导Tca8113细胞线粒体肿胀，有空泡形成；5μg/mlTL诱导Tca8113细胞后，核染色质趋边凝集，可见凋亡小体。　　3讨论TL是从卫柔科植物雷公

7、藤中提取的一种主要活性成分，有抗癌、抗肿瘤、抗免疫排斥、抗菌等作用〔2〕。且能与多种化疗药物协同作用，强化化疗效果或逆转肿瘤细胞耐药。本研究应用MTT染色法检测不同浓度TL对Tca8113细胞的增殖抑制率收到了较为满意的结果，抑制率分别为28.3%、33.9%和47.6%，具有明显的剂量依赖性，组间比较差异显著。MTT试剂可被哺乳动物活细胞线粒体中的脱氢酶还原成蓝色甲臜颗粒，且甲臜生成的量与活细胞数量及细胞活化状态成线性关系，具有一定的客观性。因此被广泛用于抗肿瘤药物的筛选和细胞