蛋白质的分离与纯化

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1、蛋白质的分离与纯化蛋白质分离纯化的基本流程
选择材料和预处理
细胞的破碎及细胞器的分离
蛋白质的抽提
蛋白质的纯化
浓缩、干燥和保存一、材料的选择和预处理微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先除去结缔组织和脂肪组织。对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。二、细胞的破碎（一）机械方法：主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。

2、高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），适用于动物内脏组织的破碎。
玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料；也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度比高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。
小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。（二）物理方法：主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎。
反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
超声波法：用

3、一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料；只要有设备，该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。（三）化学及生物化学法
有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等使细胞膜破坏；细菌细胞壁较厚，采用溶菌酶处理效果更好。此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。细胞器的分离制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞

4、组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，以便于获得更好的分离效果。细胞器的分离一般采用差速离心法细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。细胞器的分离制备，介质的选择现一般用蔗糖、Ficoll或葡萄糖-聚乙二醇等溶液。三、蛋白质的提取提取是将经过预处理或破碎了的细胞或组织置于一定条件下的溶剂中，让被提取的蛋白质以溶解状态充分地释放出来，并尽可能保持原来的天然状态，不丢失生物活性的过程。大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质

5、则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂，使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。水溶液提取法
大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。
注意事项
温度：一般采用低温（4℃以下）操作
盐浓度：等渗盐溶液以

6、0.02～0.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用；0.15mol/L氯化钠溶液应用也较多。
pH：提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取；这些有机溶剂具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的脂蛋白提取液。
必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越
丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强。
丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。
丁

7、醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。表面活性剂的利用对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，可以采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷基磺酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（TritonX-100、TirtonX-114、吐温60及吐温80）等。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，使用较多。对提取物的保护无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使生物大分子降解，导致天然产物的量减少。二异丙基

8、氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；碘乙酸可以抑制活性中心有巯基的蛋白水解酶的活性苯甲磺酰氟化物（PMSF）能清除蛋白水解酶活力还可通过选择pH、温度或离子强度等，使反应条件适合于目