涤痰化瘀法对高血压左心室肥厚模型大鼠心肌细胞凋亡的影响

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1、涤痰化瘀法对高血压左心室肥厚模型大鼠心肌细胞凋亡的影响作者：陈茹琴熊平周欣欣梁兆球吴良芝【摘要】【目的】观察涤痰化痰法对高血压左心室肥厚模型大鼠心肌细胞凋亡的影响。【方法】选用SPF级SD大鼠62只，随机分为5组：正常对照组，假手术组，中药低、高剂量组（分别按8.5、19.0g·kg-1·d-1剂量灌服涤痰化瘀方煎液）；后3组均采用二肾二夹法复制高血压模型，手术35d后各组按设计剂量连续给药60d；观察各组血压、左室质量及全心质量，检测各组大鼠左心室质量指数（anCoulte)；多参数细胞周期分析软件(MultiCycleSoftanCoulter公司)；胶原酶、胰酶、乙二胺四乙酸（EDT

2、A）均购自Sigma公司；TP1020生物组织脱水机、EG1140石蜡包埋机、RM2135轮转式石蜡切片机均由德国LEica公司生产；CSIV型摊片烤片机（孝感市电子仪器厂）；CX41OLYMPUS图像分析系统（日本OLYMPUS公司）；RBP1B型大鼠血压计(中日友好临床医学研究所研制)。1.2中药及制备涤痰化瘀方组成为陈皮9g、橘红9g、、法半夏9g、瓜蒌9g、枳壳9g、赤芍10g、川芎10g、丹参20g、桃仁5g、红花10g、枸杞15g、杜仲10g、炙甘草3g，由广州致信中药饮片有限公司提供。加蒸馏水适量煎煮2次，每次煮沸30min，合并滤出液，浓缩，密封，高温高压灭菌，4℃存

3、放备用。1.3动物与分组SD雄性SPF级大鼠62只，体质量（80±10）g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证：SCXK（粤）2003粤监证字2006A015。动物随机分为5组，分别为正常对照组8只，假手术组10只，高血压模型组14只，中药低、高剂量组各15只。各组大鼠适应饲养3d后测血压、体质量，除假手术组和正常对照组外，其他各组均采用二肾二夹法复制高血压模型。手术35d后，中药低、高剂量组均灌胃给予涤痰化瘀方煎液，剂量分别为8.5、19.0g.kg-1.d-1，其他组给予等容积生理盐水，给药60d后，处死大鼠取材。1.4高血压大鼠模型的复制［9］术前给大鼠称体质量、测血压，用100

4、g/L水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔麻醉，仰卧位固定，剪去腹部手术野毛发，皮肤消毒后于剑突下1cm沿腹正中线切开皮肤及肌层，切口约1.5cm，切口两边铺放浸过生理盐水的纱布，钝性分离双侧肾动脉，用镊子取0.3mm的U型银夹将其垂直套入，待肾动脉落入银夹顶部的小孔内，用镊子锁闭银夹造成狭窄，手术避免损伤肾脏、肝脏、乳糜池及肾静脉。判断肾动脉的方法：将其提起后肾脏颜色由红褐色变灰白色，则为肾动脉。手术完成后，向腹腔内注射2mL的庆大霉素注射液，缝合肌肉与皮肤创口，连续3d常规肌注5U青霉素。术后血压大于术前的3个标准差且高于15.3kPa，则确定模型成立。假手术组游离肾动脉，不套银夹，正常对

5、照组不手术。1.5大鼠血压(SBP)的测量采用尾袖法，每周测定大鼠清醒状态下的尾动脉收缩压。1.6检测指标1.6.1左心室肥厚的主要指标实验结束，将禁食12h的大鼠称体质量(mbody)，用100g/L的水合氯醛行腹腔注射，麻醉后开胸取出心脏，迅速置于4℃预冷生理盐水中冲洗血污，滤纸吸干称质量，沿房室交界处去除心房和大血管，去除右心室游离壁，分离左心室并称质量(mLV)，并计算左心室质量指数：LV/mbody。1.6.2病理学检查常规取材，用体积分数为10%中性福尔马林液固定、脱水、包埋、切片、苏木素—伊红（HE）染色，显微镜下观察。1.6.3心肌细胞凋亡率的测定取新鲜心肌组织约50mg，

6、以冷磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织残留血液。用眼科剪将组织剪成1mm3大小，2.5g/L胰酶EDTA和0.25g/L的胶原酶将心肌组织消化成单细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清。重悬沉淀于冷PBS中，过300目滤网，细胞计数，调整细胞浓度为5×106/mL，1000r/min离心5min；用体积分数为70%的乙醇固定，4℃过夜；检测前将保存的标本用PBS洗2次，按照试剂盒说明依次加入膜穿孔剂、碘化丙啶(PI)，室温避光染色20min，采用流式细胞仪进行凋亡细胞的检测。1.6.4统计学方法采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。2结果2.1一般情况术后大鼠共存活52只（其中

7、假手术组死亡2只，手术组死亡8只，均为手术意外死亡）。术后第5周，造模各组血压皆明显升高，实验结束时，共存活48只，正常对照组存活8只，假手术组存活8只，模型组存活10只，低剂量组存活11只，高剂量组存活11只。死亡原因：模型组感染死亡1只，心力衰竭死亡1只；低剂量组、高剂量组灌胃各死亡1只。2.2各组大鼠血压、左心室质量指数的变化表1结果表明，手术后，大鼠的血压有显著升高趋势，持续用药60d后，模型组与正常对照组血压比