低分子姬松茸多糖对bel

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1、低分子姬松茸多糖对Bel作者：牛英才赵学梅张春林春荣李雪岩刘吉成【摘要】目的探讨低分子姬松茸多糖(aloolecularAgaricusblazEI,LMPAB)对人肝癌细胞Bel-7402端粒酶-RNAmRNA表达的影响。方法5，10和20μg·ml-1浓度的LMPAB处理体外培养的Bel-7402细胞48h后，采用原位杂交法检测端粒酶-RNAmRNA表达。结果LMPAB下调体外培养Bel-7402端粒酶-RNAmRNA的表达，呈剂量依赖性。与空白对照组比较，端粒酶-RNAmRNA的表达差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论LMPAB具有下调

2、端粒酶-RNAmRNA表达的作用，进而降低端粒酶活性，抑制肿瘤细胞生长。【关键词】低分子姬松茸多糖抗肿瘤端粒酶端粒酶是目前所发现的恶性肿瘤最为广谱的分子标记，在绝大多数恶性肿瘤中阳性表达，而在造血细胞和胚胎肝细胞以外的正常组织细胞内为阴性表达，端粒酶活性是恶性肿瘤发生重要标志之一［1］。肿瘤细胞经化疗杀伤或诱导分化后端粒酶活性显著降低，提示针对端粒酶活性的药物可能为治疗肿瘤提供新的途径［2］，端粒酶可作为抗肿瘤治疗的一个新靶点。多糖是由单糖连接而成的生物大分子物质，多糖的糖链能控制细胞的增殖和分化，调节细胞的生长与衰老，在抗肿瘤和促进免疫力方面疗

3、效明确，毒副作用小［3］。近年来，多糖的抗肿瘤活性研究受到越来越广泛的关注。本研究采用原位杂交法，观察低分子姬松茸多糖（aloolecularAgaricusblazei,LMPAB）对Bel-7402细胞端粒酶-RNAmRNA表达的影响，探讨LMPAB抗肿瘤的机制。1器材与方法1.1材料1.1.1药物LMPAB由齐齐哈尔医学院医药科学研究所分离提取［4］；猪苓多糖注射液购自江苏省正大天晴药业股份有限公司；姬松茸粗多糖购自浙江庆元博瑞药业有限公司。1.1.2细胞Bel-7402细胞株购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。1.1.3试剂与仪器DABk

4、it/DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；RNase-freeH2O（宝生物工程有限公司）；RPMI-1640MEDIUMcellculturereagents（Hyclone）；Trypsin0.25%Solution（Hyclone公司）。PM-20型全自动显微摄影仪（日本OLYMPUS）；COIC型倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；MoticMed6.0数码医学图像分析系统（北京麦克奥迪图像技术有限公司）。SuperFrostPlus原位杂交专用载玻片（美国Erie科技公司）；原位杂交专用盖玻片（武汉博士德生物工程有限公司）。1.1

5、.4杂交探针序列端粒酶-RNA：①5'-TAGGCGCCGTGCTTTTGCTCCCCGCGCGCT-3'；②5'-AAAATGTCAGCTGCTGGCCCGTTCGCCCCT-3'；③5'-GATTCCCTGAGCTGTGGGACGTGCACCCAG-3'。1.2方法1.2.1细胞培养从液氮罐中取出保存Bel-7402冻存管，迅速放置37℃温水中轻轻摇动，使其尽快融化。在超净工作台内用酒精消毒冻存管后，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管，并加10倍培养液，混合后低速离心，除去上清液，重复洗涤细胞1次。分别加入5mlDMEM培养液，吹散细胞，将细胞悬

6、液吸至培养瓶中，放入37℃、5%CO2浓度的培养箱中培养过夜。次日，观察细胞生长贴壁情况，更换新鲜培养液，继续培养。待细胞生长到覆盖80%瓶底壁时，准备传代。倒掉瓶内旧培养液，加适量0.25%胰酶，使消化液流遍所有细胞，37℃消化细胞约5min，显微镜下观察细胞变形，加入含血清的培养液终止消化，并用吸管轻轻反复吹打贴壁的细胞，使细胞完全脱落。将细胞悬液移入离心管，1500r/min离心5min，弃上液，加入适量DMEM培养液吹散细胞。取适量细胞悬液在显微镜下用细胞计数板计数，然后按一定细胞数量分别接种于新的培养瓶中，放入37℃、5%CO2浓度的培

7、养箱中培养。.L.编辑。1.2.2细胞爬片的制备当Bel-7402细胞处于对数生长期，倒掉培养瓶内旧培养液，加适量0.25%胰酶，37℃消化约5min。显微镜下观察，细胞脱落变形后，加含血清培养液终止消化，并用吸管轻轻反复吹打，使贴壁细胞完全脱落。将细胞悬液移入离心管，1500r/min4℃离心5min，弃上液，加入适量的DMEM培养液吹散细胞。取适量细胞悬液计数，用RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清）将细胞悬液浓度调整为1×105cell·ml-1。预先在24孔培养板孔内滴几滴培养基，取约1/3大小的SuperFrostPlus原位杂

8、交专用载玻片置于无菌24孔培养板中，取细胞悬液传代于培养孔内，每孔加细胞悬液500μl（5×104cell）后，分别加入浓度为LMPAB