as模型兔主动脉平滑肌与骨骼肌中vldl受体亚型

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1、AS模型兔主动脉平滑肌与骨骼肌中VLDL受体亚型【摘要】　　极低密度脂蛋白受体（VLDLR）分为两型，Ⅰ型受体含有胞外O连接糖链结合域，Ⅱ型受体不含O连接糖链结合域。在疾病状态下，某些组织中VLDLR亚型分布发生改变，为了验证VLDLR亚型分布变化是否与机体脂质代谢紊乱有关，运用RTPCR技术对VLDLR亚型在动脉硬化（AS）家兔模型组织中的分布和表达进行研究。研究发现，与正常家兔相比，在AS家兔中，骨骼肌Ⅰ型受体表达略有上调，主动脉平滑肌Ⅰ型受体上调幅度比骨骼肌高，但亚型分布并没有明显改变。【关键词】极低

2、密度脂蛋白受体（VLDLR）;VLDLR亚型;OLink糖链结合域　　极低密度脂蛋白受体（VLDLR）［1］属于低密度脂蛋白受体（LDLR）超家族［2］，主要结合富含ApoE的脂蛋白（VLDL、LDL、LPR、CM、CM残粒）。该受体广泛分布于哺乳动物体内的各种组织，但不同的组织表达量并不一样，在甘油三酯活跃的心肌、骨骼肌、脂肪、大脑组织中，VLDL受体的表达较高，其次是肾脏、胎盘、胰腺、肺和大脑，肝脏中表达微量或没有表达［2～4］，说明VLDLR的主要功能是介导组织细胞摄取富含apoE的脂蛋白而参与甘油三酯的

3、代谢［5］。　　VLDLR超家族在结构上的共同特征包括：①N端富含半胱氨酸的配体结合重复序列（Ligandbindingrepeats,LBR），此为配体结构域;②表皮生长因子前体同源重复序列；③丝氨酸、苏氨酸副集区，由第16外显子编码，此区域是受体紧靠胞膜的胞外段，可通过OO连接与炭水化合物连接形成衣被；④单链跨膜区；⑤胞内区（具一致性四肽序列AsnProTyr,NPXY的内吞信号），每个区域均负担特定的功能。该家族成员之间最突出的差异在与LBR的数目。LDLR含7个LBR，VLDLR含8个LBR［6～

4、8］。Yamamato等人对日本大耳白兔各组织的VLDL受体进行研究，发现VLDLR存在16外显子剪切变异体，于是根据VLDL受体胞外段是否含有Olink糖链结合域分为两种亚型，Ⅰ型受体含有此区域，Ⅱ型受体不含此区域。O连接糖链域的缺失据认为是在受体mRNA成熟过程中不同的选择剪切所致。两种亚型的VLDLR的组织分布并不一致：Ⅰ型受体主要分布于骨骼肌、心肌、脂肪、脑干等组织中；Ⅱ型受体主要分布于肺、脾脏、肾脏、肾上腺、睾丸、卵巢、子宫、大脑、小脑等组织器官和某些病理条件下的组织细胞中。对两种受体的功能研究显示

5、，两种亚型的VLDLR均可与VLDL、RAR结合，Ⅰ型受体摄取VLDL的能力与稳定性均强于Ⅱ型受体，Ⅱ型VLDL受体胞外段水解脱落的更快，但两种亚型受体在受体的摄取、内吞、胞内降解等方面无明显差别。　　本实验对VLDLR两种亚型在正常和AS家兔骨骼肌和主动脉平滑肌中的分布进行研究，并进一步探讨造成受体亚型表达变化的原因，以期获得VLDLR亚型表达与分布相关的资料以及对VLDLR的功能与调节的初步研究。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1试剂异硫氰酸胍、DEPC、MMLV反转录酶、Oligod（T）、Ta

6、q聚合酶，均购于Promega公司;氯仿、异丙醇购于上海试剂公司;水饱和酚购于北京Bioasia公司;dNTP购于TaKaRa公司;胆固醇购于上海试剂公司。　　1.1.2实验标本　　正常家兔组织取材：取正常家兔1只，颈动脉放血法处死，打开胸腔，取骨骼肌约1mg。取下主动脉从左心室到膈肌这一段剪下，PBS冲洗去血液，将动脉剪开，用大头针固定于蜡块上，用手术刀轻轻刮表面破坏内皮，PBS再次漂洗，用手术刀轻轻在动脉内面划“井”形切口，用眼科镊撕下动脉平滑肌层，约1mg。加入变性剂（异硫氰酸胍，十二烷基肌酸钠，柠檬酸钠，

7、β巯基乙醇）700μl，-70℃冷冻保存。　　动脉硬化（AS）模型兔的取材：选取3～6月龄的健康家兔，建立动脉硬化（AS）模型兔，所用兔饲料为普通干饲料中添加3%甘油三酯和1%胆固醇，在饲料房自制。饲养3个月后，取兔的骨骼肌、主动脉平滑肌层各约1mg，加入变性剂（异硫氰酸胍，十二烷基肌酸钠，柠檬酸钠，β巯基乙醇）700μl，-70℃冷冻保存。　　1.2方法　　1.2.1总RNA的提取取1mg组织，加入700μl变性剂，冰浴，匀浆至无明显组织块，置冰中5min，加入NaAc（4mmol/L，pH4.2）70μl，震

8、荡混匀，冰浴1min；加入等体积酚/氯仿混合物（4：1），震荡混匀；静置5min；4℃离心12,000rpm15min;弃沉淀，移上清液入一新的EP管，加等体积异戊醇沉淀2hr，离心15,000rpm30min，可见微黄色的RNA沉淀，溶于适量去离子水中。取1μl稀释250倍，经紫外分光光度计分析，如果OD260/OD280>1.9,则表明蛋白质杂质较少，可用于反转