极低频率电磁场对离体肿瘤细胞的诱导凋亡作用

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1、极低频率电磁场对离体肿瘤细胞的诱导凋亡作用【摘要】目的探讨极低频率电磁场对体外培养肿瘤细胞的抑制作用。方法将人成骨肉瘤细胞（MG63）、乳腺癌细胞（MCF7）和肝癌细胞（HepG2）接种到96孔板中,并置于磁场强度分别为10mT、20mT、40mT、60mT的磁场中进行干预，每天刺激2次，每次1h，作用3天，同时每种细胞设置正常条件下的对照组。3天后以MTT法检测细胞活性(OD值)，并采用流式细胞技术（AnnexinV—FITC和PI双标）检测3种细胞的凋亡情况。结果72h后以MTT法检测3种细胞的OD值，并于正常对照组进行比较，SPSS软件统计结果显示，磁场组的O

2、D值较正常组低（P<0.05）;流式细胞技术结果显示，磁场组肿瘤细胞凋亡细胞的阳性比例高于正常组，两组之间的差异有显著性统计学意义。结论极低频率电磁场对肿瘤细胞有明显抑制作用，在一定程度上诱导肿瘤细胞的凋亡。【关键词】极低频率电磁场肿瘤细胞凋亡MTT现国内外许多学者都有应用磁场治疗肿瘤的报道,并取得一定的疗效。但磁场对于离体肿瘤细胞的作用及其原理的报道相对较少,本研究采用极低频率电磁场干预对数生长期的3种肿瘤细胞,并和正常生长条件下的肿瘤细胞相比较,旨在了解磁场对体外生长肿瘤细胞增殖、分化的影响,为磁场治疗肿瘤提供实验性的依据。1材料和方法1.1实验材料1.1

3、.1磁场来源极低频率电磁场由武汉市海军工程学院提供（型号：DL—D03由天津中环电工有限公司制造）。额定电压250V，单相频率50Hz，由可调变压器及电阻调节输出磁场强度。1.1.2研究对象三种肿瘤细胞中HepG2由华中科技大学同济医学院附属同济医院肝外科实验中心提供，MG63和MCF7由本实验室保存。1.1.3主要试剂胎牛血清和1640培养基为Hyclone公司产品。MTT、二甲基亚砜（DMSO）、Annexin－Ⅴ／FITC和PI、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、荧光显微镜、ELX800UV型酶标测试仪、流式细胞仪（同济医学院免疫教研室）。1.2实验方法1.2.1

4、肿瘤细胞生长形态观察干预前及干预后72h,在相差显微镜下观察各组3种细胞的生长形态。1.2.2MTT(四甲基偶氮唑蓝)比色法测定细胞活力将培养至第三代的3种细胞以0.25％胰酶消化后，吹打制成单个细胞悬液（调整细胞密度为1.0×104），分别接种5块到96孔板中。每块96孔板1～3列为不含细胞的血清，以消除血清物质对光吸收值的影响；4～6列为MG63细胞悬液；7～9列为MCF7细胞悬液；10～12列为HepG2细胞悬液。第1块96孔板为正常对照组，放置于37℃、5％CO2的培养箱；第2～5块板分别放置于37℃、5％CO2并含有磁场线圈的培养箱中。96孔板放于线圈的中

5、央，通过调节变压器来达到预设的磁场强度。第2～5块96孔板的磁场强度分别为10mT、20mT、40mT、60mT，刺激时间为每天2次，每次持续1h。3天后每孔加入MTT溶液20μl，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃上清液，每小孔加入DMSO150μl融解结晶物，振荡10min后在酶标仪上测定各孔的吸光值。1.2.3流式细胞仪检测各组3种肿瘤细胞凋亡的比例磁场强度及磁场作用的时间和方法同前。磁刺激停止后，胰酶消化细胞并调整细胞浓度为1×106个/ml。取1ml细胞1000r/min4℃离心10min，弃上清；加入1ml4℃的PBS轻轻振荡使细胞悬浮，1000r/min

6、4℃离心10min后弃上清，重复本步骤共3次；将细胞悬浮于250μl的结合缓冲液中，取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μlAnnexin－Ⅴ／FITC和10μlPI溶液，混匀后室温避光孵育15min，在反应管中加入400μl的PBS后，流式细胞仪（FACS）检测分析。每组取5样本,每样本计数1×106个细胞,并计算其阳性率。在480nm的激发光下，检测3种肿瘤细胞凋亡细胞占细胞总数的比例。1.3统计学处理实验结果以±s表示,采用SPSS11.0统计软件，应用单因素方差分析进行统计学处理。2结果2.1各组肿瘤细胞生长形态观察干预后至72h,磁场各组和对照组

7、肿瘤细胞均有明显的生长,正常组细胞体积饱满，细胞密集；磁场组细胞体积较正常组小,密度稀疏，贴壁细胞脱落,凋亡上浮的细胞明显增多（通过预实验中收集3种贴壁生长细胞磁场干预72h后的细胞悬液进行流式分析）。2.2MTT(四甲基偶氮唑蓝)比色法测定细胞活力在不同强度磁场刺激后各组的光密度值均数（OD值，±s）(见表1)和不同磁场强度对肿瘤的抑制率（见表2）。结果可见，在正常对照组，3种肿瘤细胞生长状态良好，其OD值均高于各磁场组；在各磁场组的OD值均有不同程度的下降，其最大抑制率可达34.82%（MG63，20mT组），其中MG63和MCF7均在20mT出现最大抑制率