dna提取过程中各种试剂的作用及原理　

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1、DNA提取过程中各种试剂的作用及原理溶菌酶:它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的1,4糖苷键，胃真有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖:增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，滅御脱氧核糖核酸酶对的降廉作用（DNase作用时需要一定的金属离子作凝基）；（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。2.溶液II-NaOH-SDS液：NaOH：核酸在pH大于5,小于9的溶液中，是稳定的。但当pH〉12或pH

2、<3时，就会引起双链之间盡键游解莓而变性。在溶液II中的NaOH浓度为ft2mol/Z,加抽提液时，该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）廉聚ffl胞中的後蛋沒。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-0-S03—-R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀V有z。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。3.溶液III—3mol/LN

3、aAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/LNaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS—蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。4.为什么用无水乙醇沉淀DNA?用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀

4、DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵）。但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵，最

5、后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15—30分钟即可。5.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaC1至最终浓度达0.1〜0.25mol/L?在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaC1,使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影

6、响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA,又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc,也可以收到较好效果。7.为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲

7、系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH),可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(P04)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE中的EDTA會o氯仿的作用主要是使蛋"白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇的作用是消除抽提过程中出

8、现的泡沫。氯仿是强蛋白质变性剂，抑制RNA酶的活性，