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1、中药何首乌总基因组DNA的提取【关键词】何首乌；,,DNA提取；,,AFLP 摘要：目的为获得高质量的何首乌总基因组DNA。方法采用CTAB法提取，对其提取方法进行改进。结果用改进的方法提取的样品DNA的OD260/OD280值在1.630~1.955之间，琼脂糖凝胶上主带清晰、降解较少，能完全被限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ完全酶切，得到合适的AFLP指纹样式。结论改良的CTAB法提示提取何首乌DNA的理想方法，适合AFLP-PCR反应和其他分子生物学应用。 关键词：何首乌；DNA提取；AFLP GenomicDNAExtractionfromthePolygonum
2、multiflorumThunb. Abstract：ObjectiveToisolatehigh-qualitygenomicDNAfromPolygonummultiflorumThunb.MethodsCTABisolationmethododifiedinthispaper.ResultsUsingthemodifiedCTABmethods,thevalueofOD260/OD280ofDNAsplifiedbythepolymerasechainreaction(PCR).SharpfingerprintpatternsofAFLPprovedCTABmethod
3、alforanalysisofAFLP-PCRandothermolecularbiologyresearch. KeymultiflorumThunb.;DNAisolation;Amplifiedfragmentlengthpolymorphism 何首乌系多年生落叶草本植物，始载于《开宝本草》，又名乌肝石、赤首乌石、夜交藤,是蓼科Polygonaceae植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的块根,具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨之功效,是滋补肝肾常用中药之一。产陕西南部、甘肃南部、华东、华中、华南、四川、云南及贵州，几乎遍及全国。生山谷灌丛
4、、山坡林下、沟边石隙，海拔200~3000m〔1〕。中药产地不同、品种不同，其成分、功效及药用品质就有很大的差异〔2〕。因此，准确鉴定何首乌品种是保证临床用药安全有效的前提。DNA分子标记技术的出现引起了人们的高度重视，目前已广泛应用于在中药的鉴定上。植物细胞除了具有细胞壁外，还含有大量的多糖、脂类、色素和酚类等次生物质，给基因组DNA的提取和纯化带来很多的困难，因此如何从中提取到高纯度的基因组DNA用于分子遗传分析是个关键的问题。由于不同的植物所含的次生物质不一样，因此，对不同的植物采取不同的DNA提取方法，以保证DNA的质量〔2〕。本文采用了改良的CTAB法提取何首乌基因组
5、DNA，探讨提取效果，并将各种方法提取的DNA用于AFLP扩增，从而筛选出适合于AFLP扩增的何首乌基因组DNA的提取方法。 1器材与方法 1.1材料何首乌叶片采自广东德庆县德城镇，经华南植物园邢富武教授鉴定，用干燥剂将叶片干燥后置于－20℃冰箱备用。 1.2仪器Sigma1-15KCentrifuge，BeckmenDU-530紫外分光光度计，GeneAmpPCRSysterm2400(PERKINELMER)，水浴锅，研钵等。 1.3试剂CTAB、尿素、Tris碱、EDTA、PVP40、RnaseA、β-巯基乙醇等购于北京鼎国生物公司（genevieer由上海生物工
6、程有限公司合成，dNTP、Taq聚合酶、T4连接酶购自Takara宝生物（大连）有限公司,EcoRⅠMseⅠ购自Neleppendorf管中,加入1ml2%CTAB抽提缓冲液65℃保温45～60min,(2%CTAB抽提缓冲液：2%CTAB，100mmol/LTris-HClpH8.0,20mmol/LEDTA,1.4mol/LNaCl,2%巯基乙醇),期间轻缓颠倒摇动数次；取出eppendorf管，使之恢复室温，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)抽提,轻缓颠倒混匀,室温下12000r/min离心10min，吸取上清液；再加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)重复抽提1次,离心后吸
7、取上清液加入2/3体积预冷异丙醇,混匀,-20℃下放置30min或过夜,4000r/min离心10min,小心去上清液,用70%乙醇洗涤1次,溶于200μl0.1TE（1.0mmol/Tris－HClpH8.0，0.1mmolEDTApH8.0）中,加入3～5μlRNaseA储备液（10mg/ml），在37℃保温1h以裂解RNA；保温后用等体积氯仿-异戊醇(24∶1)再抽提1次，将水相转入另一1.5mleppendorf管，加入1/5体积10mol/LNH4Ac（使其终浓度为2mol/L），
