enos基因转染对慢性缺氧性肺动脉高压的影响

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1、eNOS基因转染对慢性缺氧性肺动脉高压的影响作者：周锦，王俊科，张铁铮，金强，张毅男，王凤学【关键词】高血压,肺性；基因疗法；一氧化氮合酶；重组,遗传；腺病毒科　　Effectofadenovirusmediatedhumanendothelialnitricoxidesynthasegenetransferonchronichypoxicpulmonaryhypertension　　【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectofadenovirusmediatedhumanendothelialnitricoxidesynthase(eNO

2、S)gene(AdCMVceNOS)transferedtotheratlungsthroughaironaryhypertension(CHPH)ratsandtoexploreitspossibleroleinCHPHtherapy.METHODS:ThirtymaleVceNOStransferredgroup(groupT).TheAdCMVceNOS(3×109pfu)onaryarterypressure(PAP),rightventricularonaryarteryrespectivelyafter3d.TheexpressionactivityofeNO

3、SmunohistochemistryandVceNOS)对慢性缺氧性肺动脉高压大鼠的影响，探讨其可能的作用机制.方法：雄性VceNOS转染组（T组），每组10只.采用呼吸道转染途径，将3×109空斑形成单位的AdCMVceNOS转入大鼠肺脏.3d后测平均肺动脉压、右心室重量及肺动脉血NO含量，并采用免疫组化及VceNOS)，通过气道转染途径进行转基因，观察AdCMVceNOS对CHPH大鼠的影响，探讨AdCMVceNOS对CHPH治疗作用的可能机制，为CHPH的防治提供新思路和新方法.　　1材料和方法　　1.1材料雄性VceNOS病毒DNA，由美国德克萨斯大学西南医学中

4、心惠赠；S/5多功能生理记录仪芬兰DatexOhmeda公司.　　1.2方法　　1.2.1重组腺病毒载体制备AdCMVceNOS病毒DNA用脂质体法体外转染293细胞，包装完整病毒颗粒并扩增.经两次氯化铯密度梯度离心纯化及缓冲液透析后，应用TCID50法测定病毒滴度为1.99×1010pfu/mL.将病毒载体用病毒保存液，稀释成5×109pfu/mL滴度备用.　　1.2.2CHPH模型复制及动物处理VceNOS转染组（T组），每组10只.H组和T组大鼠置于常压低氧箱内，将氮氧混合气（900mL/L氮气和100mL/L氧气的混合气）通入低氧箱，箱内放置变色硅胶和无水氯化钙吸

5、收CO2和水份.在麻醉气体监测仪监测下，使O2浓度平衡在(10.0±0.5)%，CO2浓度为(3.0±0.5)%.每天置入8h，连续4g/kg)和阿托品(0.2mg/kg)麻醉，经口气管插管(14号塑料导管)行机械通气.将大鼠头朝上直立，于呼气末用手按压胸廓尽力排出肺内气体，在松手同时用微量注射器迅速将AdCMVceNOS50μL注入T组大鼠气管内，继而注入空气200μL使病毒均匀分布于各肺叶.然后放平大鼠继续机械通气，间隔5min重复该操作1次(共12次)，每只接受病毒载体总量为3×109pfu.C组和H组只注入等容量病毒保存液，各组大鼠苏醒后拔出气管导管，单笼饲养3d

6、后待检.　　1.2.4肺动脉压和右心室重量比大鼠腹腔注射水合氯醛(35mg/kg)麻醉后，切开颈前右侧皮肤游离颈外静脉，将内径1mm的聚乙烯导管充盈肝素盐水插入右颈外静脉，并缓慢将其推至右心室然后进入肺动脉.导管外端连接压力转换器和生理多导仪，测平均肺动脉压(mPAP).同时颈外动脉插管，接换能器记录仪，检测平均颈动脉压（mCAP）.放血处死大鼠，迅速剪开胸腔取出心、肺.右下肺置于40g/L多聚甲醛（含1g/LEPC）中固定，余肺置于液氮内冷冻待测.剪去右心房组织，沿室间隔边缘剪下右心室，分别称取右心室游离壁（RV）和左心室与室间隔（LV+S）质量，计算RV/(LV+S)

7、质量比，作为右室肥大指标.　　1.2.5肺动脉血NO含量测定实验前数日大鼠少食含氮食物，实验前空腹12h以上.测定mPAP后从肺动脉采血2mL,采用硝酸还原酶法测定NO.　　1.2.6免疫组织化学分析采用SABC法，标本分别滴加小鼠抗人eNOSmAb.4℃冰箱过夜后，滴加生物素化山羊抗鼠抗体工作液，再滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育30min后行DAB显色及苏木素复染.用PBS替换一抗，作阴性对照.阳性反应为胞质内显棕褐色颗粒.　　每张肺组织切片随机选取5个视野，用全自动图像分析仪检测eNOS阳性染色物质的平均吸光度值