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时间:2018-11-12
《原位杂交法检测视网膜色素上皮细胞炎前因子mrna的表达》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、原位杂交法检测视网膜色素上皮细胞炎前因子mRNA的表达 摘要:目的观察视网膜色素上皮细胞(RPE)在炎性介质刺激下炎前因子mRNA的表达.方法培养的人RPE经IL-1β(10μg・L-1)和脂多糖(1mg・L-1)的刺激后,用生物素标记的寡核苷酸探针进行原位杂交,检测RPE炎前因子IL-1β,IL-6,IL-8和TNF-αmRNA表达.杂交结果使用图像分析法进行比较.结果原位杂交显示RPE细胞质中均呈现浓淡不一的淡蓝色着色,胞核不着色.其中IL-6mRNA在脂多糖刺激下染色较浅,增加脂多糖的剂量不能提高其表达.图像分析
2、显示在IL-1β(10μg・L-1)和脂多糖(1mg・L-1)刺激下,RPE表达IL-6mRNA的吸光度分别为108±18和35±14,二者之间有显著性差异(P<0.01).结论在IL-1β和脂多糖刺激下,人RPE可以表达炎前因子IL-1β,IL-6,IL-8和TNF-α的mRNA. Keyentepithelium;retina;insituhy-bridization;proinflammatoryfactors;mRNA Abstract:AIMTodetermineentepi-thelium(RPE)
3、expressesproinflammatoryfactorsmessengerRNA(mRNA)inculturedRPEcellsstimulatedbyinflam-matoryfactors.METHODSCulturedRPEtreatedg・L-1)odels.ThepresenceofmRNAcodingforIL-1β,IL-6,IL-8andTNFαageanalysisedtodeterminestainingdifferencesbe-tRNApositivecellsshoafterbeingstimulate
4、dRNAshoRNAexpression.ImageanalysisshoRNAexpressionu-latedRNAencodingforIL-1β,IL-6,IL-8andTNF-αiseffectivelydetectedbyISHinculturedhumanRPEstimulatedmatoryfactors. 0引言 增生性玻璃体视网膜病变(proliferativevitreoretinopathy,PVR)是常见的致盲性眼病之一,其发病的分子机制是目前眼底病研究的热点[1-3].临床研究发现许多炎前因子mRNA和蛋白质在PVR
5、膜中不同程度的表达,与PVR的发生明显相关,其中IL-1β,IL-6,IL-8和TNF-α在玻璃体切割液和PVR膜中水平较高[4-8].视网膜色素上皮细胞(reti-nalpigmentepithelium,RPE)是PVR膜中的主要细胞成分,RPE细胞移行、增殖和分泌胶原在PVR形成中可能起重要的作用[1-8].我们用原位杂交法观察培养RPE在炎性介质作用下炎前因子IL-1β,IL-6,IL-8和TNF-αmRNA的表达,以明确RPE是否表达炎前因子的mRNA,从而进一步了解PVR发生的分子机制. 1材料和方法 1.1材料第3代RPE细胞由王
6、雨生副教授惠增,培养条件为37℃,50mL・L-1CO2,用含100mL・L-1血清的DMEM培养.对近融合期细胞以2.5g・L-1胰蛋白酶消化进行传代.选6~8代细胞用于实验.细胞培养主要试剂有:DMEM培养基(Gibco产品)、胰蛋白酶(Sigma产品)和小牛血清(杭州四季青产品).将18mm×18mm的盖玻片分成4小块,高温高压消毒后多聚赖氨酸包被.无菌玻片平铺于直径10cm的培养皿中,将200μL密度为4×104mL-1RPE悬液滴于的盖玻片中央,培养4h后补足培养液.细胞将近铺满时捞出玻片.终止培
7、养前6h加入脂多糖(lipolysaccharride,LPS)1mg・L-1,或者IL-1β10μg・L-1.切片用PBS漂洗3次,40g・L-1多聚甲醛固定1~2h干燥后-20℃保存. 1.2方法 1.2.1培养细胞的鉴定取细胞铺片采用SABC法,进行抗人角蛋白免疫组织化学染色.鼠抗人细胞角蛋白单抗系Dako产品;SABC试剂盒为博士德生物工程公司产品. 1.2.2杂交探针生物素标记IL-1β,IL-6,IL-8和TNF-α寡核苷酸探针产自上海基康生物技术公司,探针序列分别为IL-1β:5’-TC
8、ATCCTCATTGCCACTGTAATAAGCCATC-3’;IL-6:5’-CTCACTACTCTCAAATCTGTT
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