他汀类药物对神经细胞和神经胶质细胞abca1基因表达的影响

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1、他汀类药物对神经细胞和神经胶质细胞ABCA1基因表达的影响他汀类药物是临床常用的一类降血脂药物[12]，其主要成分为胆固醇合成限速酶羟甲戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶的抑制剂。辛伐他汀(simvastatin)和普伐他汀(pravastatin)已广泛应用于高血脂症的临床治疗。由于该药阻断甲羟戊酸的生化途径，不但能抑制胆固醇的合成、降低血浆LDL的水平、阻止巨噬细胞向泡沫细胞的转化，而且可以显著降低因高血脂引起的动脉粥样硬化性疾病的死亡率[3]。此外，研究表明，他汀类药物还可以升高血浆高密度脂蛋白　　(highdensitylipoprotein,HDL)和载脂蛋白A。　　AT

2、P结合盒式转运体1(ATPbindingcassettetransporter1,ABCA1)是ATP结合盒式转运蛋白之一，它以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出，在胆固醇逆转运(RCT)和HDL生成的起始步骤中起重要作用。ABCA1基因错义突变所引起的杂合子型Tangier疾病，就是由于apoAI所介导的胆固醇流出减少、HDLC浓度降低和颗粒直径变小而造成[4]。作为潜在的抗粥样硬化的靶点之一，上调ABCA1基因的表达具有重要意义。apoAI是HDL中主要的蛋白质，是细胞胆固醇逆向转运的特殊重要因素。apoAI能与磷脂、多种血浆因子及细胞膜受体结合,可以激活卵磷脂胆固

3、醇酰基转移酶(LCAT)，起着促进细胞内胆固醇的移出、酯化、转移、以及调节HDL代谢的作用[5]。　　以往学者认为，他汀类药物可能对老年痴呆症有一定的预防作用[6]。但是，近年来有关他汀类药物可能导致老年痴呆症或者加重原有症状的报道越来越多[79]。目前，有关他汀类药物对中枢神经系统ABCA1基因的影响还未见报道。本实验通过观察辛伐他汀、普伐他汀对正常神经细胞和神经胶质细胞中ABCA1基因表达的影响，初步解释了他汀类药物有可能造成患者老年痴呆症的发生或者症状加重的原因，为进一步揭示他汀类药物的作用机制及其与神经系统退行性疾病的关系打下一定的基础。　　1材料与方法　　1.1材料神经细胞

4、系H2(CRL10742)购自美国ATCC公司，神经胶质细胞系为本实验室保存。辛伐他汀、普伐他汀、甲羟戊酸、FPP和GGPP均购自SIGMA公司。RNA提取试剂盒购自美国QIAGEN公司。MemPER真核细胞膜蛋白提取试剂盒购自美国Pierce公司。　　1.2方法硕士论文发表　　1.2.1细胞培养常规培养神经元和神经胶质细胞，分别用含有150mL/L和50mL/L胎牛血清的DMEM培养基进行培养，待细胞汇合成片，胰酶消化后分别转入12孔板内，放入50mL/LCO2培养箱中37℃培养观察，待细胞生长成片时，用不含血清的培养基分别配置5μmol/L的辛伐他汀、20μmol/L普伐他汀

5、、100μmol/L甲羟戊酸、10μmol/L的FPP、10μmol/LGGPP，充分混匀。分别设立空白对照组、辛伐他汀实验组(S)、普伐他汀实验组(P)、辛伐他汀+甲羟戊酸实验组(SM)、普伐他汀+甲羟戊酸实验组(PM)、辛伐他汀+FPP实验组(SF)、普伐他汀+FPP实验组(PF)、辛伐他汀+GGPP实验组(SG)、普伐他汀+GGPP实验组(PG)。放入培养箱继续培养48h。　　1.2.2逆转录反应离心收集细胞，预冷PBS洗涤1次后用QIAGEN试剂盒提取细胞总RNA。取1μg细胞总RNA，5×逆转录缓冲液5μL，RNasin(40u/μL)20u，10mol/L4×dNTPs2μ

6、L，用DEPC处理的H2O补足至23μL。混合均匀后于70℃反应5min，加入2μL反转录酶，37℃反应1h后，90℃热灭活5min，置-20℃贮存备用。　　1.2.3荧光定量RTPCR检测ABCA1的表达采用　　ABIPRISM7700Sequencedetector荧光定量PCR仪，以18S为内参。反应体系如下：吸取逆转录反应产物5μL，上、下游引物各10pmol/L，荧光探针5pmol/L，5×PCR缓冲液10μL，10mol/L4×dNTPs1μL，TaqDNA聚合酶1.5μL(2u/μL)，用灭菌纯水补足至50μL，在PE7000(美国ABI公司)上，93℃预变性3min后

7、按如下条件进行循环：93℃30s，55℃45s，72℃20s，共40个循环。设置阴性对照和阳性梯度对照，实验结果由电脑软件分析。引物序列如下，F：5′TGGTTCTATGCCCGCTTGA3′;R：5′ACCTTAGATCCCCCGACAAAG3′。　　1.2.4emPER真核细胞膜蛋白提取试剂盒提取细胞膜蛋白。采用BioRad公司的垂直电泳装置电泳，并用半干法转膜。杂交按照KPL公司的ProteinDetectorTanneva