项目五 对流免疫电泳试验

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1、项目五对流免疫电泳试验(Counterimmunoelectrophoresistest)　【实验原理】在适宜缓冲液和电场条件下，由于琼脂凝胶中的抗原和相应抗体在电泳和电渗作用下能相对移动，所以二者会在加样的两孔之间相遇，并在它们浓度比例合适之处形成白色沉淀线。据此临床常用该方法检测抗原，以诊断某些疾病。　【试剂和器材】　　1．AFP阳性血清、待检血清、抗AFP诊断血清。2．pH8.60.05mol/L巴比妥缓冲液。　　　巴比妥钠　　　10.3g巴比妥1.84g　　先将巴比妥置于三角烧瓶中，加入200ml

2、蒸馏水，加热溶解后再加入巴比妥钠，最后加蒸馏水至1000ml。　　3．琼脂凝胶　按需要量称取琼脂粉，加入pH8.60.05mol/L巴比妥缓冲液，使琼脂浓度为12g/L，沸水浴中溶解至澄清。　　4．电泳仪、电泳槽、万用电表。　　5．载玻片、绘图笔尖、吸管、滴管等。　【步骤和方法】1．制备琼脂凝胶板　取溶化的琼脂3~4ml，浇于载玻片上，冷却后打孔。2．打孔　用绘图笔尖按图1-6打孔，孔径约3mm，孔距4~5mm，挑去孔中凝胶。3．加样　用滴管按图1-6分别加入抗血清、AFP阳性血清、待检血清，以加满孔为宜

3、，注意不要溢出。4．电泳　将加好样的琼脂凝胶板置于电泳槽中，抗原孔侧置阴极端，抗体孔侧置阳极端，两端分别以2~3层滤纸或纱布搭桥，使凝胶和槽中缓冲液相接。按通电源，将电压控制在4~6V/cm长，或电流3~4mA/cm宽，电泳30~60min。【结果判定】电泳完毕后关闭电源，待15~30min后取出琼脂凝胶板观察结果，或照相、染色后保存。阳性对照孔与抗血清孔之间必须出现沉淀线，否则试验须重做。待检血清孔与抗血清孔之间出现白色沉淀线为阳性，不出现者为阴性。1阳性对照孔2~4待检血清孔　　　　　　　　　　　　　

4、　图1-6对流免疫电泳【注意事项】1．当标本为脂血症、陈旧血标本或由于α2-巨球蛋白可引起假阳性，它靠近阳极呈弧状。为排除这种假阳性可用参比电泳鉴别，即阳性对照孔与待检孔间距为0.2cm，在两孔中间相距0.4cm处打抗血清孔，加样后电泳，两沉淀线吻合为阳性，相交为阴性，其它试验条件与以上试验相同。2．电泳缓冲液的pH值、离子强度、电压和电泳时间对检测结果均有影响，应注意控制。3．电泳时间随孔间距的增大需适当延长。当两孔距离为1cm时，电泳时间为1.5～2h；孔间距为0.6cm时，电泳时间为1h。4．抗原与

5、抗体浓度比例应适当，可通过稀释抗原适当调整，以免出现假阴性。　【方法评价】　　1．简便、快速，敏感度比双相免疫扩散法高8~16倍。　2．必须使用高特异性、高亲合力的诊断抗体，否则结果难以解释。3．必须选用有高电渗作用的琼脂作支撑介质。【临床意义】对流免疫电泳在临床常用于定性检测某些抗原，以对某些疾病或传染病作快速诊断。也可用于抗原的半定量测定，或根据沉淀线位置、形状作抗原和抗体相对浓度的分析。由于该方法分辨率差，当有多种抗原抗体反应系统存在时，形成的沉淀线常重叠，而难以分辨，所以不用该方法作某种抗原或抗体

6、组分的免疫化学分析。【思考题】1．对流免疫电泳试验原理如何?为何选用高电渗作用琼脂作为凝胶介质？2．为何对流免疫电泳比双相免疫扩散试验敏感性高？　　　项目六火箭免疫电泳试验(Rocketimmunoelectrophoresistest)　　　【实验原理】抗原在含一定浓度抗体的琼脂板一端，在电场作用下，向另一端泳动时抗原抗体复合物形成的沉淀呈圆锥形，状似火箭而得名。它实质上是在电场作用下的凝胶内单相免疫沉淀试验。当抗体含量不变时，沉淀峰的高度与抗原浓度成正比。因此用已知不同浓度标准抗原制成标准曲线，即可求

7、出标本中抗原含量，所以又称单相定量免疫电泳。　【试剂和器材】　　1．pH8.60.05mol/L巴比妥缓冲液。2．30g/L缓冲琼脂　称取3.0g琼脂粉置250ml三角烧瓶中，加蒸馏水50ml，沸水浴中溶解，然后加入上述巴比妥缓冲液50ml混匀后，置4℃冰箱保存备用。　　3．AFP诊断血清。　　4．待检样品(脐带血清或肝癌病人AFP阳性血清)。　　5．参考血清(已知AFP标准抗原)。　　6．电泳仪、电泳槽、37~65℃水浴箱、万用电表。　　7．载玻片、打孔器、微量加样器等。　【步骤和方法】　　1．取30g

8、/L缓冲琼脂，置水浴煮沸溶化，放52℃水浴平衡。　　2．释释血清　根据抗体的效价，用0.025mol/L巴比妥缓冲液将抗体作适当稀释(一般作1:20~1:50稀释)，置52℃水浴保温。　　3．浇板　将稀释抗血清与30g/L缓冲琼脂等量混合，注意保温，防止产生气泡(在水浴中操作，动作要轻缓)，用吸管吸取混匀琼脂迅速滴加于载玻片上，每片琼脂量3.5ml。载玻片要放在水平台上，使浇注的琼脂板厚度均匀。4．打孔　取冷凝后的琼脂板，在距